ミクロトーム

ミクロトーム(ギリシャ語のmikros (「小さい」を意味する) とtemnein (「切る」を意味する) に由来) は、 切片 と呼ばれる材料の非常に薄いスライスを作成するために使用される切断ツールであり、このプロセスはマイクロセクショニングと呼ばれます。科学において重要なミクロトームは、透過光または電子線の下で観察するためのサンプルを準備するために顕微鏡で使用されます。

ミクロトームは、スライスする標本と切断する切片の希望の厚さに応じて、スチール、ガラス、またはダイヤモンドの 刃を使用します。スチール刃は、光学顕微鏡用に動物または植物組織の組織学的切片を準備するために使用されます。ガラスナイフは、光学顕微鏡用に切片をスライスしたり、電子顕微鏡用に非常に薄い切片をスライスしたりするために使用されます。工業用グレードのダイヤモンドナイフは、光学顕微鏡と電子顕微鏡の両方で、骨、歯、丈夫な植物などの硬い材料をスライスするために使用されます。宝石品質のダイヤモンドナイフも、電子顕微鏡用に薄い切片をスライスするために使用されます。

ミクロトーム法は、骨、鉱物、歯などの材料の薄片を作成する方法であり、電解研磨やイオンミリングの代替手段です。ミクロトーム切片は、人間の髪の毛の幅を切断できるほど薄く作成でき、切片の厚さは 50 nm～ 100  μmです 。

光学顕微鏡の開発当初は、植物や動物の切片はカミソリの刃を使って手作業で作成されていました。観察対象の標本の構造を観察するには、光が透過する 100 μm 程度のきれいな再現性のある切片を作ることが重要であることがわかりました。これにより、透過モードで光学顕微鏡を使用してサンプルを観察できるようになりました。

このような切断を準備するための最初の装置の一つは、1770年にジョージ・アダムス・ジュニア（1750-1795）によって発明され、アレクサンダー・カミングスによってさらに開発されました。^[2]この装置は手動で操作され、サンプルはシリンダー内に保持され、手動クランクを使用してサンプルの上部からセクションが作成されました。^{[1] [3]}

1835年、アンドリュー・プリチャードはテーブルベースのモデルを開発しました。このモデルでは、装置をテーブルに固定することで振動を遮断し、操作者とナイフを分離することができました。^[4]

ミクロトームの発明は解剖学者ヴィルヘルム・ヒス・シニア（1865年）によるものとされることもある。 ^{[5] [6]ヴィルヘルムは著書}「Beschreibung eines Mikrotoms（ドイツ語でミクロトームの説明）」 の中で次のように書いている。

この装置により、手作業では絶対に作成できない断面を正確に作成できるようになりました。つまり、研究の過程で物体の切れ目のない断面を作成できる可能性が生まれました。

他の資料では、このモデルの開発はチェコの生理学者ヤン・エヴァンジェリスタ・プルキニェによるものとされている。^[7] いくつかの資料では、プルキニェモデルが初めて実用化されたモデルであると説明されている。^{[8] [9]}

ミクロトームの起源が不明瞭なのは、最初のミクロトームが単なる切断装置であったことと、初期の装置の開発段階がほとんど文書化されていないことに起因しています。

1800年代の終わりには、ミクロトーム法による非常に薄いサンプルや一貫して薄いサンプルの開発と、重要な細胞成分や分子の選択的染色により、顕微鏡で細部を視覚化できるようになりました。^{[10] [11]}

現在、ミクロトームの大半は、交換可能なナイフ、標本ホルダー、および前進機構を備えたナイフブロック設計です。ほとんどの装置では、サンプルの切断はサンプルをナイフの上に移動させることから始まり、前進機構が自動的に前進して、選択した厚さの次の切断が行われます。切片の厚さは調整機構によって制御され、正確な制御が可能です。

ミクロトームの最も一般的な用途は次のとおりです。

• 伝統的な組織学技術：組織は固定され、脱水され、透明化され、溶融パラフィンに包埋され、冷却されると固体ブロックを形成する。次に、組織はミクロトームで2〜50μmの厚さに切断される。そこから組織は顕微鏡スライドに載せられ、パラフィンを除去した後、適切な水性染料で染色され、光学顕微鏡で検査される。^[12]
• 凍結切片法: 水分を多く含む組織を凍結により硬化させ、凍結ミクロトームまたはミクロトームクライオスタットで凍結状態で切断します。切片を染色し、光学顕微鏡で検査します。この手法は従来の組織学よりもはるかに高速 (16 時間に対して 5 分) で、医療処置と組み合わせて使用​​することで迅速な診断を実現します。凍結切片は免疫組織化学にも使用できます。組織を凍結すると、固定剤を使用するよりも組織の劣化が早く止まり、化学組成がそれほど変化したり隠されたりしないからです。
• 電子顕微鏡法: 組織をエポキシ樹脂に包埋した後、ガラスまたは宝石グレードのダイヤモンドナイフを装備したミクロトームを使用して非常に薄い切片 (通常 60 ～ 100 ナノメートル) を切り出します。切片は適切な重金属塩の水溶液で染色し、透過型電子顕微鏡で検査します。この器具は、ウルトラミクロトームと呼ばれることがよくあります。ウルトラミクロトームは、薄切片化の前に調査切片を切り出すために、ガラスナイフまたは工業グレードのダイヤモンドナイフとともに使用されます。これらの調査切片は通常 0.5 ～ 1 μm の厚さで、ガラススライドにマウントされ、TEM 用に薄切片化する前に光学顕微鏡で関心領域を見つけるために染色されます。TEM 用の薄切片化は、宝石グレードのダイヤモンドナイフで行われることがよくあります。従来の TEM 技術を補完するウルトラミクロトームは、SEM チャンバー内にマウントされることが増えています。これにより、ブロック面の表面を画像化し、その後ミクロトームで取り除いて、画像化用の次の表面を露出させることができます。この技術は、シリアルブロックフェイス走査電子顕微鏡(SBFSEM) と呼ばれます。
• 植物ミクロトーム技法: 木材、骨、皮革などの硬い材料には、スレッジミクロトームが必要です。これらのミクロトームは刃が重く、通常のミクロトームほど薄く切ることはできません。
• 分光法(特にFTIRまたは赤外線分光法) 技術: 赤外線ビームが検査中のサンプルを透過できるように、薄いポリマー切片が必要です。サンプルは 20 ～ 100 μm の厚さに切断するのが一般的です。薄い切片のさらに小さな領域をより詳細に分析するには、サンプル検査に FTIR顕微鏡を使用できます。

最近開発されたのがレーザーミクロトームです。これは機械的なナイフの代わりにフェムト秒レーザーで対象標本を切断します。この方法は非接触で、サンプルの準備技術を必要としません。レーザーミクロトームは、ほぼすべての組織を本来の状態でスライスする機能を備えています。処理する材料に応じて、10～100 μm のスライス厚が可能です。

セクション間隔は主に次のいずれかに分類できます。

• 連続切片作成: パラフィンブロックから連続したリボン状の切片を取得し、すべてをスライドとして使用します。
• ステップセクション: ブロック内の指定された深さで収集されます。

精密に切断された腎臓切片とは、腎臓機能、薬物代謝、または疾患過程を研究するためにミクロトームを使用して作成された腎臓組織の薄い切片を指します。研究者はこれらの切片を使用して、物質が腎機能に与える影響を研究します。^{[13] [14]}これには、薬物代謝^{[15] [16]}と毒性物質の影響が含まれます。^[17]

スレッジミクロトームは、サンプルを固定ホルダー（シャトル）に配置し、ナイフ上を前後に動かす装置です。最新のスレッジミクロトームは、スレッジがリニアベアリング上に配置されており、ミクロトームが多くの粗い切片を容易に切断できる設計になっています。^[18]サンプルとミクロトームナイフの角度を調整することで、切断中にサンプルにかかる圧力を軽減できます。^[18]この設計のミクロトームの一般的な用途は、生物学的標本用にパラフィンに包埋されたサンプルなど、大きなサンプルの調製です。スレッジミクロトームで達成できる一般的な切断厚さは、1〜60 μmです。

この器具は一般的なミクロトームの設計です。この装置は段階的な回転動作で作動し、実際の切断は回転動作の一部となります。回転式ミクロトームでは、ナイフは通常垂直位置に固定されています。^[19]

左の図では、切断の原理を説明しています。サンプルホルダーの動きにより、サンプルはナイフの位置 1 から位置 2 まで切断され、その時点では新しい切片がナイフ上に残ります。回転運動の最高点で、サンプルホルダーは作成される切片と同じ厚さだけ前進し、次の切片を作成できるようになります。

多くのミクロトームのフライホイールは手動で操作できます。フライホイールの質量が比較的大きいため、サンプルの切断中にサンプルが停止することがないため、きれいな切断ができるという利点があります。新しいモデルでは、フライホイールがミクロトームのケース内に統合されていることがよくあります。回転式ミクロトームの一般的な切断厚さは 1 ～ 60 μm です。合成樹脂に埋め込まれたサンプルなどの硬い材料の場合、この設計のミクロトームでは、厚さ 0.5 μm の良好な「半薄」切片を作成できます。

凍結サンプルの切断には、多くの回転式ミクロトームを液体窒素チャンバー内で切断するように改造することができます。これはいわゆるクライオミクロトームセットアップです。温度を下げると、ガラス転移を起こすなどしてサンプルの硬度が上がり、半薄サンプルを準備できるようになります。^[18]しかし、サンプルの温度とナイフの温度を制御して、結果として得られるサンプルの厚さを最適化する必要があります。

ウルトラミクロトームは、ウルトラミクロトームの主なツールです。回転式ミクロトームと同じように機能しますが、機械構造の許容誤差が非常に厳しく、非常に薄い切片を作製できます。慎重な機械構造の結果、マウントの線形熱膨張を利用して、厚さを非常に細かく制御できます。^[18]

これらの極薄切片は、透過型電子顕微鏡(TEM) や連続ブロックフェイス走査型電子顕微鏡(SBFSEM) で使用する場合に重要であり、光学顕微鏡でも重要な場合があります。^[19]これらの切片の一般的な厚さは、透過型電子顕微鏡では 40 ～ 100 nm、SBFSEM では 30 ～ 50 nm です。特殊な TEM アプリケーションや、最終的な薄切片の領域を選択するための光学顕微鏡調査切片では、最大 500 nm の厚さのより厚い切片も採取されます。ウルトラミクロトームでは、ダイヤモンドナイフ(推奨) とガラスナイフが使用されます。切片を収集するには、切片を液体の上に浮かべ、TEM 標本観察に適したグリッド上に慎重に拾い上げます。切片の厚さは、サンプルの厚さが極端に薄いために見られる反射光の薄膜干渉色によって推定できます。 ^[20]

振動式ミクロトームは振動する刃を使って切断するため、固定刃よりも少ない圧力で切断することができます。振動式ミクロトームは通常、扱いが難しい生物学的サンプルに使用されます。^[18]切断厚さは、生体組織の場合は通常約30～500μm、固定組織の場合は10～500μmです。^[21]

鋸型ミクロトームは、特に歯や骨などの硬い材料に適しています。このタイプのミクロトームには、サンプルをスライスする凹んだ回転鋸が付いています。最小切断厚さは約30μmで、比較的大きなサンプルでも使用できます。^[18]

レーザーミクロトームは非接触スライス用の器具です。^{[22]包埋、凍結、化学}固定などの事前サンプル準備は不要で、準備方法によるアーティファクトを最小限に抑えることができます。また、この設計のミクロトームは、骨や歯などの非常に硬い材料や一部のセラミックにも使用できます。サンプル材料の特性に応じて、達成可能な厚さは10〜100μmです。

この装置は、赤外線レーザーの切断作用を利用して動作します。レーザーは近赤外線を放射するため、この波長領域ではレーザーが生物学的物質と相互作用する可能性があります。サンプル内でプローブをシャープに焦点を合わせることで、最大TW /cm ²の非常に高い強度の焦点を実現できます。焦点領域での光透過の非線形相互作用により、光破壊と呼ばれるプロセスで物質の分離が行われます。レーザーパルス持続時間をフェムト秒範囲に制限することで、ターゲット領域で消費されるエネルギーが正確に制御され、切断の相互作用ゾーンがマイクロメートル未満に制限されます。このゾーンの外側では、超短時間のビーム照射時間により、サンプルの残りの部分への熱損傷は最小限またはまったく発生しません。

レーザー放射は、高速走査ミラーベースの光学システムに向けられ、ビームクロスオーバーの 3 次元配置が可能になり、同時にビームを目的の領域に横断させることができます。高出力と高ラスター レートの組み合わせにより、スキャナーは短時間でサンプルの広い領域を切断できます。レーザー ミクロトームでは、組織、細胞構造、その他の種類の小さな特徴の内部領域のレーザー マイクロ解剖も可能です。

ミクロトームナイフのブレードプロファイルの選択は、サンプルの材質と準備、および最終的なサンプルの要件（カットの厚さや品質など）によって異なります。

一般的に、ナイフはナイフの刃の形状によって特徴付けられ、平面凹面、くさび形、またはノミ形のデザインのカテゴリに分類されます。

平面凹面ミクロトームナイフは非常に鋭いですが、非常に繊細でもあるため、非常に柔らかいサンプルにのみ使用されます。^[19]くさび形ナイフはやや安定しており、エポキシや極低温サンプルの切断など、中程度の硬さの材料に使用されます。最後に、鈍い刃を持つチゼル形ナイフはナイフの安定性を高めますが、切断にはかなりの力が必要です。

ウルトラミクロトームにはガラスとダイヤモンドのナイフが必要で、刃の切断幅は数ミリ程度で、従来のミクロトームのナイフよりも大幅に小さくなります。ガラスナイフは通常、特殊な「ナイフメーカー」破砕装置を使用してガラス棒を破砕して製造されます。ダイヤモンドナイフが最終的な切片作成に使用される場合でも、ガラスナイフは最初のサンプル準備に使用できます。ガラスナイフには通常、プラスチックテープで作られた小さな溝があり、そこに水を入れてサンプルを浮かせて後で収集できるようにします。^[18]ダイヤモンドブレードをそのような既存の溝に組み込むことで、同じ収集方法が可能になります。

ミクロトームで切断する前に、生物材料は通常、包埋と呼ばれるプロセスで、より硬い固定剤に入れられます。これは、パラフィン (ワックス) やエポキシなどの液体物質をサンプルの周囲に流し込み、型に入れて硬化させて、簡単に切断できる「ブロック」を作成することで実現されます。

偏角とは、サンプルの垂直面とナイフの刃の接触角です。ナイフの刃が直角 (偏角 = 90) の場合、圧力ベースのモードで直接切断が行われるため、力は比例して大きくなります。ただし、ナイフが傾いている場合は、ナイフの相対的な動きがサンプルの動きとますます平行になり、スライス動作が可能になります。この動作は、大きなサンプルや硬いサンプルの場合に非常に重要です。

ナイフの傾斜とは、ナイフ面とサンプルの間の角度です。最適な結果を得るには、この角度を適切に選択する必要があります。最適な角度は、ナイフの形状、切断速度、その他の多くのパラメータによって異なります。角度をゼロに調整すると、ナイフの切断が不安定になることが多く、これを滑らかにするためにナイフの位置を変更する必要があります。

角度が大きすぎると、サンプルがくしゃくしゃになり、ナイフで切ったときに周期的な厚さの変化が生じる可能性があります。角度をさらに大きくして大きすぎると、ナイフの刃自体が損傷する可能性があります。

• 組織学
• 顕微鏡
• 精密に切断された肺のスライス

ウィキブック医療機器には、ミクロトームに関するページがあります。

ウィキメディア・コモンズには、ミクロトームに関連するメディアがあります。

• 「ミクロトミー」 ブリタニカ百科事典（第11版）。1911年。