免疫蛍光

免疫蛍光法 （IF）は、細胞または組織内のさまざまな標的生体分子を定量的に検出および局在化できる光学顕微鏡ベースの技術です。この技術は、抗体と抗原の結合特異性を利用します。^[1]抗体が抗原上で認識する特定の領域はエピトープと呼ばれます。複数の抗体が同じエピトープを認識できますが、結合親和性は異なります。特定のエピトープに対する親和性が高い抗体は、同じエピトープに対する親和性が低い抗体よりも優れています。^{[2] [3]}

抗体を蛍光体に結合することで、蛍光体を励起し、蛍光顕微鏡を使用して特定の波長での発光を測定することで、標的生体分子の位置を視覚化します。抗体自体への蛍光体の結合が、抗体の免疫学的特異性や抗原の結合能力を妨げないことが不可欠です。 ^{[4] [5]}

免疫蛍光法は、免疫染色（抗体を使用してタンパク質を染色する） の広く使用されている例であり、免疫組織化学（組織内の抗体と抗原の関係を使用する）の具体的な例です。この技術は主に蛍光体を使用して抗体の位置を視覚化しますが、他の技術では、対象の抗原を含む環境で色の変化を引き起こしたり、放射性ラベルを使用したりします。標識抗体を使用する免疫蛍光法は、1940年代にアルバート・H・クーンによって概念化されました。^{[2] [6] [7]}

免疫蛍光法は基礎科学研究や臨床診断に利用されており、組織切片、培養細胞株、個々の細胞など、多様な基質にわたる多面的な有用性を示しています。その用途には、タンパク質、グリカン、小さな生物学的および非生物学的分子の分布の分析、および中サイズのフィラメントなどの構造の可視化が含まれます。^[8]

細胞膜のトポロジーが未決定の場合、タンパク質へのエピトープ挿入を免疫蛍光と組み合わせて使用​​​​することで、細胞膜内の構造を決定することができます。^{[9]免疫蛍光（IF）は、DNAメチル化のレベルと局在パターンを理解するための「半定量的」方法として使用できます。IFは、} DNAを標識するためのDAPIの使用など、他の非抗体蛍光染色法と組み合わせて使用​​​​することもできます。^{[10] [11]}

免疫蛍光標本の検査は、落射蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、広視野顕微鏡など、さまざまな顕微鏡構成を利用して行うことができます。 ^[12]

免疫蛍光染色を行うには、蛍光体を抗体に結合（「タグ」）する必要があります。染色手順は、細胞内に保持された発現抗体、または生細胞上の細胞表面抗原の両方に適用できます。免疫蛍光染色技術には、一次（直接）と二次（間接）の2つの一般的なクラスがあります。^{[1] [2]}以下の説明では、主に結合抗体の観点からこれらのクラスに焦点を当てます。^[12]

一次（直接）免疫蛍光法（DIF）では、蛍光体と結合した単一の抗体を使用します。抗体は標的分子（抗原）を認識し、エピトープと呼ばれる特定の領域に結合します。結合した蛍光体は蛍光顕微鏡で検出することができ、蛍光体の種類に応じて、励起されると特定の波長の光を発します。^{[1] [14]}

蛍光体を抗体に直接結合させることで、サンプル調製手順のステップ数が減り、時間が節約され、分析中の非特異的なバックグラウンド信号が減少します。^[12]これにより、抗体の交差反応性やプロセス全体での間違いの可能性も制限されます。 DIF の欠点の 1 つは、抗原に結合できる抗体の数が限られていることです。この制限により、この技術の感度が低下する可能性があります。標的タンパク質が低濃度でしか入手できない場合は、二次 (間接) 免疫蛍光法と比較して、 DIF よりも感度が高いと考えられている二次 IF の方が適切なアプローチです^{[2] [12] 。 [1]}

二次（間接）免疫蛍光法（SIF）は直接免疫蛍光法に似ていますが、この技術では2種類の抗体を使用しますが、そのうちの1つだけが結合蛍光体を持っています。結合蛍光体を持つ抗体は二次抗体と呼ばれ、結合していない抗体は一次抗体と呼ばれます。^[1]

この技術の原理は、一次抗体が標的分子のエピトープに特異的に結合し、結合した蛍光体を持つ二次抗体が一次抗体を認識して結合するというものである。^[1]  

この技術は、複数の二次抗体が同じ一次抗体に結合できるため、一次免疫蛍光法よりも感度が高いと考えられています。抗原あたりの蛍光分子の数が増えると、放出される光の量が増え、シグナルが増幅されます。^[1]蛍光抗原比を高めるためのさまざまな方法があり、アビジン-ビオチン複合体（ABC法）や標識ストレプトアビジン-ビオチン（LSAB法）などがあります。^{[15] [16]}

細胞内の構造を調べる場合、免疫蛍光法は固定された（つまり死んだ）細胞に限定されます。抗体は大きなタンパク質であるため、生きた細胞内の無傷の細胞膜や細胞内膜を透過しないからです。これらの構造を視覚化するには、抗原物質を細胞内の自然な場所にしっかりと固定する必要があります。^{[17]生きた細胞内の構造を蛍光と組み合わせて調べるには、蛍光タンパク質ドメインを含む}組み換えタンパク質、たとえば緑色蛍光タンパク質（GFP）を利用できます。GFP技術では、細胞の遺伝情報を変更します。^{[18] [19]}

免疫蛍光法の大きな問題は光退色であり、^[12]蛍光体が光を放出する能力を永久に失う。^[1]光退色のリスクを軽減するために、さまざまな戦略を採用することができる。強度や光曝露時間を減らすか制限することで、蛍光の吸収-放出サイクルが減少し、蛍光体の機能が維持される。また、蛍光体の濃度を高めたり、Alexa Fluors、Seta Fluors、DyLight Fluorsなど光退色に強いより強力な蛍光体を選択したりすることもできる。^[2]

免疫蛍光法を使用する際に生じる可能性のあるその他の問題には、自己蛍光、スペクトルの重複、非特異的染色などがある。^{[1] [2]}自己蛍光には、サンプル組織または細胞自体から放出される自然な蛍光が含まれる。スペクトルの重複は、蛍光体が広い発光スペクトルを持ち、それが別の蛍光体のスペクトルと重複して、偽のシグナルを生じる場合に発生する。非特異的染色は、蛍光体を含む抗体が、エピトープの類似性が十分にあるために、意図しないタンパク質に結合する場合に発生する。これにより、偽陽性が生じる可能性がある。^{[2] [4] [1]}

免疫蛍光法の主な改良点は、蛍光体と蛍光顕微鏡の開発です。蛍光体は構造的に改変することで、スペクトル特性と細胞透過性を維持しながら、明るさと光安定性を向上させることができます。^[20]

超解像蛍光顕微鏡法は、回折限界によって制限される顕微鏡よりも高い解像度の画像を生成することができる。これにより、細胞内の構造の詳細を決定することができる。^[21]蛍光における超解像とは、より具体的には、顕微鏡がスペクトル的に同一の隣接する蛍光体の同時蛍光（スペクトルの重なり）を防ぐ能力を指す。最近開発された超解像蛍光顕微鏡法には、誘導放出抑制（STED）顕微鏡法、飽和構造化照明顕微鏡法（SSIM）、蛍光光活性化局在顕微鏡法（F PALM）、および確率的光学再構成顕微鏡法（STORM）などがある。^[22]

• アルバート・ヒューエット・クーンズ（1912-1978）、医師、病理学者、免疫学者。
• コーネリア・ミッチェル・ダウンズ（1892-1987）、微生物学者、ジャーナリスト

• 抗体
• 免疫蛍光検査による皮膚疾患
• 蛍光
• 免疫化学
• 免疫組織化学
• パッチングとキャッピング

• 自己免疫疾患に関連する画像バーミンガム大学のウェイバックマシンに 2009-09-25 にアーカイブされました
• デイビッドソン大学の概要
• 米国国立医学図書館医学件名表(MeSH)における免疫蛍光