ショートヘアピンRNA

ショートヘアピンRNAまたはスモールヘアピンRNA（shRNA /ヘアピンベクター）は、タイトなヘアピンターンを持つ人工RNA分子であり、 RNA干渉（RNAi）を介して標的遺伝子の発現をサイレンシングするために使用できます。^[1]^{[2]細胞内でのshRNAの} 発現は、通常、プラスミドの送達、またはウイルスまたは細菌ベクターを介して行われます。 shRNAは、分解およびターンオーバーの速度が比較的低いという点で、RNAiの有利なメディエーターです。ただし、発現ベクターの使用が必要であり、医療用途では副作用を引き起こす可能性があります。^[3]

プロモーターの選択は、shRNAの強力な発現を達成する上で不可欠です。当初はU6やH1などのポリメラーゼIIIプロモーターが使用されていましたが、これらのプロモーターは空間的および時間的な制御が欠けていました。 ^{[3]そのため、shRNA発現を制御するために誘導可能な}ポリメラーゼIIプロモーターを使用するようになりました。

配達

細胞内での shRNA の発現は、プラスミドの送達、またはウイルスや細菌のベクターを介して得られます。

shRNA 発現を得るためにトランスフェクションによって細胞にプラスミドを送達することは、市販の試薬を使用してin vitroで行うことができます。ただし、この方法はin vivo には適用できないため、有用性は限られています。

細菌ベクターを使用して細胞内でshRNA発現を得る方法は比較的最近のアプローチです。これは、shRNAを含むプラスミドを含む組み換え大腸菌を^{マウスに与えると、腸管上皮における標的遺伝子発現をノックダウンできることを示す研究に基づいています。 [4]} この方法は、2012年に家族性大腸腺腫症の患者を治療するための臨床試験で使用されました。^[5]

細胞内で shRNA を発現させるために、アデノ随伴ウイルス(AAV)、アデノウイルス、レンチウイルスなど、さまざまなウイルスベクターを使用することができます。アデノ随伴ウイルスとアデノウイルスでは、ゲノムはエピソームのままです。これは挿入変異が回避されるので有利です。欠点は、細胞が非常にゆっくりと分裂しない限り、細胞の子孫が細胞分裂によってすぐにウイルスを失うことです。AAV は、ウイルス遺伝子が除去され、パッキング容量が減少している点でアデノウイルスとは異なります。レンチウイルスは転写活性クロマチンのセクションに組み込まれ、子孫細胞に受け継がれます。このアプローチでは、挿入変異のリスクが高まりますが、インテグラーゼ欠損レンチウイルスを使用することでリスクを軽減できます。^[6]

作用機序

ベクターが宿主ゲノムに組み込まれると、プロモーターの選択に応じて、shRNA は核内でポリメラーゼ II またはポリメラーゼ III によって転写されます。産物は pri-microRNA (pri-miRNA) を模倣し、Droshaによって処理されます。結果として生じる pre-shRNA は、Exportin 5 によって核からエクスポートされます。この産物は次にDicerによって処理され、 RNA 誘導サイレンシング複合体(RISC)にロードされます。センス (パッセンジャー) 鎖は分解されます。アンチセンス (ガイド) 鎖は、相補的な配列を持つ mRNA に RISC を誘導します。完全な相補性の場合、RISC は mRNA を切断します。不完全な相補性の場合、RISC は mRNA の翻訳を抑制します。どちらの場合も、shRNA はターゲット遺伝子のサイレンシングにつながります。

遺伝子治療への応用

shRNA は特定の遺伝子サイレンシングを長期間にわたって実現できるため、遺伝子治療への shRNA の使用に大きな関心が寄せられています。以下では、shRNA ベースの治療法の 3 つの例について説明します。

Gradalis 社は進行癌の治療に使用される FANG ワクチンを開発しました。FANG は免疫抑制性形質転換成長因子 (TGF) β1 および β2 に対する二機能性 shRNA (bi-shRNA) に依存しています。^[8] 患者から自己腫瘍細胞を採取し、二機能性 shRNA と顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 (GMCSF) をコードするプラスミドを電気穿孔法で体外導入しました。これらの細胞はその後放射線照射され、患者に再注入されました。

Marina Biotech は、家族性大腸腺腫症の治療に使用される CEQ508 を開発しました。CEQ508 は、細菌ベクターを使用して、β-カテニンに対する shRNA を送達します。

Gradalis, Inc. は、進行癌や転移癌の治療に使用される二機能性 shRNA-STMN1 (pbi-shRNA STMN1) を開発しました。この pbi-shRNA STMN1 はスタスミン 1 に対抗するものであり、二層陥入小胞 (BIV)リポプレックス (LP)技術によって腫瘍内に送達されます。

shRNA ベースの治療薬には、通常、いくつかの課題が伴います。最も重大な課題は送達です。shRNA は通常、ベクターを使用して送達されますが、一般的には効率的ですが、安全性に関する重大な懸念があります。特に、ウイルスベースの遺伝子治療アプローチは、過去の臨床試験で危険であることが判明しています。レトロウイルス遺伝子治療の第一世代では、ウィスコット・アルドリッチ症候群の治療薬としてウイルスベクターを使用した患者の一部が急性 T 細胞白血病を発症しました。これは、ウイルスベクターの挿入場所が原因であることが判明しました。^[9] RISC の潜在的な過飽和も問題です。shRNA の発現レベルが高すぎると、細胞が内因性 RNA を正しく処理できず、重大な問題を引き起こす可能性があります。もう 1 つの課題は、患者が治療に対して免疫反応を起こす可能性があることです。^[10]最後に、オフターゲット効果が発生する可能性があり、shRNA が他の意図しない遺伝子をサイレンシングする可能性があります。shRNA ベースの新しい治療薬を成功させるには、これらすべての課題を考慮する必要があります。

参照

参考文献

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