フリーフロー電気泳動

フリーフロー電気泳動（FFE ）は、キャリアフリー電気泳動とも呼ばれ、マトリックスフリーの高電圧電気泳動分離技術です。FFEはキャピラリー電気泳動に類似した技術で、同等の分解能があり、半分取および分取量のサンプルが必要な科学的質問に使用できます。pH勾配を形成することにより、電荷または等電点の違いに応じてサンプルを定量的に分離するために使用されます。この技術は多用途であるため、希少金属イオン、タンパク質アイソフォーム、多タンパク質複合体、ペプチド、細胞小器官、細胞、DNA折り紙、血清、ナノ粒子などのサンプルを分離するための幅広いプロトコルが存在します。FFEの利点は、ゲル電気泳動におけるポリアクリルアミドなどのマトリックスを必要とせずに、液体溶媒に溶解したサンプルを迅速かつ穏やかに分離できることです。これにより、分析対象物がキャリアまたはマトリックス構造に付着しないため、非常に高い回収率が保証されます。この技術は連続性と高容量処理能力を備えているため、非常に高い分解能で大量のサンプルを迅速に分離することができます。さらに、分離は天然または変性条件下で行うことができます。^[1]

FFEは1960年代にドイツのマックス・プランク研究所のクルト・ハンニグによって開発されました。^[2] 1980年代まで、FFEは細胞と細胞小器官の分離のための標準化された技術であり、FFEは無重力下での沈降を最小限に抑えるために宇宙でもテストされました。^[3]フローサイトメトリーが細胞選別の標準的な方法になったため、FFEの開発はタンパク質と荷電粒子の分離に重点が置かれました。一部のグループは、FFEシステムの小型版、つまりマイクロFFEにも取り組んでいます。^[4]

分離チャンバーは、バックプレートとフロントプレートで構成されています。バックプレートは通常、プラスチックで覆われたガラスミラーで覆われた冷却アルミニウムブロックで構成されています。フロントプレートは現在ではPMMAで作られていますが、以前はガラスが使用されていました。フロントプレートとバックプレートの間の距離はスペーサーで調整でき、通常は 0.1 ～ 0.5 mm です。フロントプレートには、分離バッファーとサンプルの入口、分画チューブの出口、および電極としての白金線も含まれています。複数のバッファー入口に異なるバッファーを適用することで、オペレーターは pH、塩濃度、または組成を変更し、チャンバーの幅全体の分離条件を変更することができます。分離バッファーとサンプルは、蠕動ポンプによって適用され、層流を確保します。高電圧電界が層流に対して垂直に適用されます。層流内の分析物は、電荷密度と等電点によって分離できます。この技術は汎用性が高いため、等速電気泳動、等電点電気泳動、（インターバル）ゾーン電気泳動など、さまざまな電気泳動モードを利用できます。^[要出典]

分離セルの端では、分離されたサンプルは分画チューブで分割され、マイクロタイタープレートに収集されます。^[5]

その後、サンプルはHPLC、LC-MS、質量分析（使用するプロトコルに応じてESI / MALDI ）、または電気泳動（IEF / SDS PAGE、2D-PAGE）などの主要な技術によって特性評価できます。^{[引用が必要]}

標準的な用途には、タンパク質複合体、膜タンパク質、タンパク質および抗体アイソフォーム、細胞、細胞内コンパートメント（オルガネラ、リボソームなど）、リポソームの高解像度分離が含まれます。^[6]両性電解質によって生成される非常に平坦な pH 勾配を利用することで、約 3 mg/h のスループットで、0.02 pH 単位未満で変化するタンパク質アイソフォームを分離できます。^[7] バッファーに添加剤を加えて分解能を高めたり、サンプルを変性させたりすることも可能です。通常、尿素の濃度は最大 8M、界面活性剤は 0.1～1% まで使用できます。CHAPS、CHAPSO、ジギトニン、ドデシル-β-D-マルトシド、オクチル-β-D-グルコシド、トリトン-X-114（IEF）、DTT は最大 50 mM まで使用できます。^[要出典]

• マトリックスフリーの分離、タンパク質活性/タンパク質複合体の保存に最適
• タンパク質複合体、膜タンパク質、タンパク質アイソフォーム、細胞、細胞内区画（細胞小器官、リボソームなど）の高解像度分離、
• 分離サイズ範囲はイオンから完全な細胞まで
• サンプルと操作モードに応じて、最大 99% のサンプル回収率
• 個々の実行の高い再現性
• 数分で分離
• 直接臨床応用のための、さまざまな市販の両性電解質と無毒性小分子 ProLytesTM を使用した等電点電気泳動分離のプロトコル
• UV、IEFゲルによる分離品質の高速かつ高感度な検出
• HPLC、MS、SDS、IEF、2D-GEなど、他の多くの下流技術と互換性があります。
• サンプルと分離チャンバーを4℃まで冷却するため、不安定なタンパク質の分離に適しています。
• さらなるプロテオーム解析の前にプロテオームの複雑さを軽減する^[8]
• 不要なタンパク質を過剰に除去することで、不足しているタンパク質を補う
• 約 50 μL から数ミリリットルまでの大小さまざまなサンプル量に対応します。
• 調製および分析操作モード
• すべての電気泳動分離モード（IEF、IZE、ZE、ITP）をサポート
• 天然または変性条件下で実行可能

• AES電気泳動協会のフリーフロー電気泳動の説明
• フリーフロー電気泳動法の特許説明