エリスポット

酵素結合免疫吸着スポット( ELISpot ) は、単一細胞のサイトカイン分泌頻度を定量的に測定することに重点を置いたアッセイの一種です。ELISpot アッセイは、抗体を使用してタンパク質分析物を検出する技術として分類されるため、免疫染色の一種でもあります。分析物という言葉は、識別または測定される生物学的または化学物質を指します。

FluoroSpot アッセイは、ELISpot アッセイのバリエーションです。FluoroSpot アッセイは、複数の分析対象物を分析するために 蛍光を使用するため、複数の種類のタンパク質の分泌を検出できます。

セシル・チェルキンスキーは、1983年にハイブリドーマ細胞による抗原特異的免疫グロブリンの産生を定量化する新しい方法としてELISpotを初めて説明しました。1988年にチェルキンスキーは、T細胞によるリンフォカインの分泌を定量化するELISAスポットアッセイを開発しました。同じ年に、デュアルカラーELISpotが初めてコンピューターイメージングと組み合わされ、スポットの計数と分析が可能になりました。1988年には、これらのアッセイを実行するためにメンブレン底プレートが初めて使用されました。^[1]

1. 抗体コーティング: ELISpot アッセイ技術全体を通じて、さまざまな物質がウェルに加えられ、ウェルから洗い流されます。ウェルは、検査する物質を入れることができる小さな皿/ボウルが付いた実験用プレートにあります。プレート上のウェルの数はさまざまですが、通常は 16 ～ 100 個です。ウェルに最初に加えられる物質は、サイトカイン特異的モノクローナル抗体です。これらの抗体は、将来サイトカインに結合するためにウェルの壁をコーティングします。モノクローナル抗体とは、抗体が単一の細胞系統から生成され、1 つのタンパク質エピトープにのみ結合できることを意味します。一方、ポリクローナル抗体は、同じタンパク質の複数のエピトープに結合することができます。
2. 細胞培養: 観察および分析する目的の細胞をウェルに追加します。各ウェルには、細胞内のサイトカインの分泌を活性化する刺激が存在する場合と存在しない場合があります。細胞培養中、細胞は存在する刺激に反応し、サイトカインを分泌します。適切な細胞処理を確実にするために従うべき手順と方法は多数あります。細胞の高品質を確保するために、血液サンプル内の細胞は、3 時間以上保存する場合は軽く撹拌し、血液サンプルは保存前に PBS (リン酸緩衝生理食塩水) で希釈し、血液サンプルには顆粒球が含まれていてはなりません。凍結保存され解凍された細胞は、37 ℃ (人体の一般的な温度) で 1 時間以上放置する必要があります。 ^[2]細胞を培養する際には、細胞がスポット形成に影響を与えるような急激な動きをしないようにすることや、過度の蒸発やウェルの乾燥を避けるためにインキュベーターの湿度が十分に高いことを確認するなど、考慮すべき点も多くあります。 ^[3]
3. サイトカイン捕捉: 細胞はウェルの壁を覆うサイトカイン特異的モノクローナル抗体に囲まれているため、培養された細胞から分泌されたサイトカインは特定のエピトープで抗体に付着し始めます。
4. 検出抗体: この時点で、細胞やその他の望ましくない物質を除去するためにウェルを洗浄する必要があります。残るのは、サイトカイン特異的モノクローナル抗体と、抗体に結合したサイトカインだけです。次に、ビオチン化されたサイトカイン特異的検出抗体をウェルに追加します。これらのサイトカイン特異的検出抗体は、最初に使用した抗体セットにサイトカインがまだ付着しているため、ウェルに残っているサイトカインに結合します。サイトカインはウェルをコーティングした最初の抗体セットに付着しているため、ウェルを洗浄してもサイトカインは洗い流されませんでした。
5. ストレプトアビジン酵素複合体：ストレプトアビジン酵素複合体は、検出抗体と結合するためにウェルに添加されます。前のステップでウェルに添加されたサイトカイン特異的検出抗体をビオチン化する目的は、抗体が新しいストレプトアビジン酵素複合体に結合できるようにすることです。ビオチン化は基本的に、サイトカイン特異的抗体上のビオチンと複合体上のストレプトアビジンの間に強い親和性を生み出します。 ^[4]
6. 基質の添加：基質​​をウェルに加え、前のステップで加えた酵素複合体によって触媒されます。この反応により不溶性の沈殿物が形成され、ウェルにスポットが形成されます。このステップで使用する基質は、前のステップで使用した酵素の種類によって異なります。ストレプトアビジン-ALP（ストレプトアビジンとアルカリホスファターゼの複合体）を使用する場合は、BCIP/NBT-plus（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸とニトロブルーテトラゾリウムクロリドの混合物） ^[5]を基質として使用すると、より明瞭なスポットが生成され、分析しやすくなります。ストレプトアビジン-HRP（ストレプトアビジンと西洋ワサビペルオキシダーゼの複合体）を使用する場合は、TMB（テトラメチルベンジジン） ^[6]を基質として使用すると、より良い結果が得られます。 ^[7]
7. 分析: 形成されたスポットは、自動 ELISpot リーダーで読み取ったり、解剖顕微鏡でカウントしたりして、サイトカイン分泌の頻度を計算するために使用できます。

FluoroSpot アッセイは ELISpot アッセイと非常によく似ています。主な違いは、FluoroSpot アッセイでは 1 つのウェルプレート上の複数の分析対象物の存在を分析できるのに対し、ELISpot アッセイでは一度に 1 つの分析対象物しか分析できないことです。FluoroSpot アッセイでは、検出に酵素反応ではなく蛍光を使用します。FluoroSpot アッセイの手順も似ていますが、いくつかの違いがあります。^[8]

1. 抗体コーティング: ELISpot と同様に、サイトカイン特異的モノクローナル捕捉抗体をウェル付きプレートに添加します。両方のアッセイでは、汚染や偏ったデータ収集を避けるためにプレートをエタノール処理します。FluoroSpot アッセイでは、複数の種類の分析物を検出するために、異なる種類の捕捉抗体の混合物をウェルに付着させます。ELISpot および FluoroSpot アッセイで最適な結果を得るには、適切なプレートコーティング技術に従う必要があります。プレートをエタノールで処理し、洗浄してから抗体でコーティングする必要があります。エタノール処理方法も、使用するプレートの種類によって異なります。MSIP および IPFL プレートの場合は、すべてのウェルに 15 マイクロリットルの 35% エタノールを添加する必要があります。エタノールをウェルに 1 分間置いてから、注ぎ出します。MAIPSWU プレートの場合は、代わりにすべてのウェルに 50 マイクロリットルの 70% エタノールを添加する必要があります。エタノールをウェルに2分間放置し、その後捨てます。ウェルをエタノールで処理した後、すべてのウェルを200マイクロリットルの滅菌水で洗浄する必要があります。この洗浄プロセスは合計5回繰り返す必要があります。ウェルをエタノールで処理して洗浄したら、サイトカイン特異的モノクローナル捕捉抗体を各ウェルに追加できます。 ^[9]
2. 細胞インキュベーション: 細胞をウェルに加え、タンパク質分泌に影響を与える刺激の有無にかかわらずインキュベートします。
3. サイトカイン捕捉: インキュベートされた細胞から分泌されるタンパク質/分析物は、最初のステップでウェルに付着した捕捉抗体に結合します。
4. 検出抗体: ELISpot と同様に、ウェルを洗浄して、識別または測定する必要のない細胞やその他の物質を取り除いた後、ビオチン化検出抗体 (定量化したい分析物の 1 つのタイプに固有のもの) を追加し、次に、調査対象の 2 番目と 3 番目のタイプの分析物用にタグ標識検出抗体を追加します。
5. 蛍光標識コンジュゲート: ストレプトアビジン酵素コンジュゲートを追加する代わりに、蛍光標識抗タグ抗体とストレプトアビジン蛍光標識コンジュゲートを使用して、FluoroSpot で複数の分析対象物の検出を増幅します。このステップでは、ウェル内の蛍光色を分析するときに後で使用する信号を強化するために、蛍光増強溶液も追加されます。この蛍光により、ELISpot とは異なり、FluoroSpot では複数の分析対象物を分析して比較することができます。
6. 分析: FluoroSpot は酵素反応ではなく蛍光を利用するため、酵素と反応する基質を追加するステップ (ELISpot で必要) は必要ありません。FluoroSpot アッセイの最後のステップは、分析対象のさまざまな蛍光体ごとに別々のフィルターを備えた自動蛍光リーダーで蛍光体を分析することです。正確な測定を行うには、蛍光体の特定の波長に合わせてこれらのフィルターを選択する必要があります。 ^[8]

FluoroSpot アッセイは複数の分析対象物の存在を識別し、定量化するため、ある分析対象の吸収が別の分析対象の分泌に影響を与える可能性があります。これを捕捉効果と呼びます。^[8]ある分析対象物が別の分析対象物に与える影響は、プラスの場合もマイナスの場合もあります (2 番目の分析対象物の生成が増加または減少する)。捕捉効果を打ち消すために、共刺激を使用して分析対象物の生成減少を回避することができます。^[8]これは、同じ分析対象物の生成を刺激する 2 番目の抗体をウェルに添加する場合です。

ELISpot および FluoroSpot アッセイは、ワクチン開発、^[10]がん、^[11]アレルギー、^[12]単球/マクロファージ/樹状細胞の特性評価、アポリポタンパク質分析、獣医学研究など、多くの研究分野で使用できます。ELISpot を使用すると、抗原特異的サイトカイン応答、抗体特異的分泌細胞、^[13]腫瘍抗原、^[11] T 細胞によるグランザイム B およびパーフォリンの放出、ワクチンの有効性、^[14]エピトープマッピング、^[15]細胞傷害性 T 細胞活性、IL-4、IL-5、および IL-13 の検出、^[12]ワクチン誘発性抗体応答、抗原特異的メモリー B 細胞、^[10]などを研究できます。

より具体的には、T細胞ELISpotアッセイはT細胞サブセットの特性評価に使用されます。これは、アッセイがサイトカインIFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-13の産生を検出できるためです。最初の3つのサイトカインはTh1細胞によって産生され、最後の3つはTh2細胞によって産生されます。サイトカイン産生を通じてT細胞反応を測定することで、ワクチンの有効性の研究も可能になります。^[16]

T細胞フルオロスポットを使用すると、腫瘍浸潤リンパ球をモニタリングできます。また、IFN-γサイトカインとグランザイムB分泌を分析して、細胞傷害性T細胞応答を評価することもできます。これらは両方とも癌研究に使用されます。^[17]

B細胞フルオロスポットでは、ワクチン接種前後のIgG、IgA、IgMの分泌量を定量化することでワクチンの有効性を観察することもできます。この複数の免疫グロブリンの分析は、フルオロスポットで使用される蛍光法によって可能になります。^[17]