ビウレット試験

化学において、ビウレット試験（IPA: / ˌ b aɪ j ə ˈ r ɛ t /、/ ˈ b aɪ j ə ˌ r ɛ t / ^{[1] ）は}ピオトロフスキー試験としても知られ、分子内に少なくとも2つのペプチド結合が存在するかどうかを検出するために使用される化学試験である。ペプチドの存在下では、銅（II）イオンはアルカリ溶液中で藤色の配位錯体を形成する。この反応は1833年に初めて観察された。^[2]ポーランドでは、ビウレット試験は、1857年に独立してこの試験を再発見したポーランドの生理学者グスタフ・ピオトロフスキー [pl]にちなんでピオトロフスキー試験としても知られている。^{[3]この試験には、} BCA試験や改良ローリー試験など、いくつかの変種が開発されている。^[4]

ビウレット反応は、ペプチド結合がペプチド内のアミノ酸ごとに同じ頻度で発生するため、タンパク質の濃度を評価するために使用できます。色の強度、つまり 540 nm での吸収は、ランベルト・ビールの法則に従って、タンパク質の濃度に正比例します。

その名前にもかかわらず、試薬には実際にはビウレット [(H ₂ N−CO−) ₂ NH]は含まれていません。このテストはビウレット分子内のペプチドのような結合にも陽性反応を示すため、このように名付けられています。

このアッセイでは、銅(II)がタンパク質のペプチドに存在する窒素原子と結合します。二次反応で、銅(II)は銅(I)に還元されます。トリスやアンモニアなどの緩衝液はこのアッセイに干渉するため、硫酸アンモニウム沈殿から精製されたタンパク質サンプルには適していません。このアッセイは感度が低く、遊離アミノ酸による干渉がほとんどないため、全組織サンプルやタンパク質濃度の高い他のソースに最も有効です。^[5]

水性サンプルを等量の1%強塩基（水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム）で処理し、続いて硫酸銅（II）水溶液を数滴加えます。溶液が紫色に変色した場合は、タンパク質が含まれています。5～160 mg/ mLを測定できます。これらの試薬で有意かつ測定可能な色の変化を得るには、少なくとも3アミノ酸の正しい長さのペプチドが必要です。^[6]

ビウレット試薬は、水酸化ナトリウム（NaOH）と水和硫酸銅（II）と酒石酸カリウムナトリウムから作られ、^[7]後者はキレート化して銅イオンを安定化させるために添加されます。銅イオンとペプチド結合に関与する窒素原子との反応により、アルカリ条件下でペプチド水素原子が置換されます。ペプチド窒素との三座または四座キレート化により特徴的な色が生成されます。これはジペプチドで見られます。^[8]

この試薬は、波長 540 nm の UV/VIS 分光法によってタンパク質濃度を測定するために使用される比色試験であるビウレットタンパク質 アッセイで一般的に使用されます。

ビウレット試験の 2 つの主要な改良法、ビシンコニン酸 (BCA) アッセイとローリーアッセイは、ペプチドの現代の比色分析でよく使用されています。これらの試験では、ビウレット反応中に形成された Cu ^{+ が}他の試薬とさらに反応し、色が濃くなります。

BCA試験では、Cu ^+がビシンコニン酸（BCA）^[9]と濃い紫色の錯体を形成し、約562 nmを吸収して特徴的な藤色を作り出します。水溶性BCA/銅錯体はペプチド/銅錯体よりもはるかに強く吸収するため、ビウレット試験の感度が約100倍に高まります。BCAアッセイでは、0.0005～2 mg/mLの範囲のタンパク質を検出できます。さらに、BCAタンパク質アッセイには、タンパク質サンプル中の最大5%の界面活性剤などの物質との適合性という重要な利点があります。

ローリータンパク質アッセイでは、Cu ^{+ は}フォリン・チオカルト試薬中のMo ^{VIによって Cu 2+}に酸化され、モリブデンブルー(Mo ^IV ) を形成します。タンパク質中のチロシン残基も、このような状況下でモリブデンブルーを形成します。このようにして、0.005～2 mg/mL の濃度でタンパク質を検出することができます。^{[10]モリブデンブルーは、}マラカイトグリーンやオーラミン Oなどの特定の有機染料と結合し、シグナルをさらに増幅します。^[11]

ウィキメディア・コモンズには、ビウレット試験に関連するメディアがあります。

• ゴールド。1990 年。生物システムにおける有機化合物、第 2 版。John Wiley & Sons、Inc。
• 化学試薬