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TEVプロテアーゼ（EC 3.4.22.44、タバコエッチウイルス核内封入体エンドペプチダーゼ）は、タバコエッチウイルス（TEV）由来の高度に配列特異なシステインプロテアーゼである。 [ 1 ]これはキモトリプシン様プロテアーゼのPAクランに属する。[ 2 ] TEVプロテアーゼは、その高い配列特異性のため、in vitroおよびin vivoでの融合タンパク質の制御された切断によく使用される。[ 3 ] TEVプロテアーゼによって認識されるコンセンサス配列はGlu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-|-Serであり、ここで「|」は切断されたペプチド結合を示す。[ 4 ]
タバコエッチウイルスは、ゲノム全体を単一の巨大なポリタンパク質（350 kDa）としてコードしています。これは、3 つのプロテアーゼ、P1 プロテアーゼ（1 つの切断部位）、ヘルパーコンポーネントプロテアーゼ（1 つの切断部位）、および TEV プロテアーゼ（7 つの切断部位）によって機能単位に切断されます。[ 1 ]天然の TEV プロテアーゼには、内部自己切断部位も含まれています。この部位は、酵素を不活性化するためにゆっくりと切断されます（その生理学的理由は不明です）。
TEVプロテアーゼの構造はX線結晶構造解析によって解明されている。[ 5 ] 2つのβバレルと柔軟なC末端テールから構成され、キモトリプシンスーパーファミリーのプロテアーゼ（MEROPS分類ではPAクラン、C4ファミリー）と構造的な相同性を示す。[ 2 ]細胞性セリンプロテアーゼ（トリプシン、エラスターゼ、トロンビンなど）と相同性があるものの、TEVプロテアーゼは触媒求核剤としてシステインを使用する（他の多くのウイルスプロテアーゼと同様）。[ 6 ]
共有結合触媒作用は、2 つのバレルに分割されたAsp-His-Cysトリオによって行われる(β1 に Asp、β2 に His と Cys)。 [ 7 ]基質は β シートとして保持され、バレル間の溝と逆平行相互作用を形成し、C 末端テールと平行相互作用を形成する。[ 8 ]したがって、酵素は基質の周囲に結合トンネルを形成し、側鎖相互作用が特異性を制御する。[ 5 ]
好ましい天然切断配列は、天然ポリタンパク質基質の切断部位を調べて繰り返し配列を調べることによって最初に特定されました。これらの天然切断部位のコンセンサスは ENLYFQ\S であり、'\' は切断されたペプチド結合を表します。[ 4 ]基質の残基は、切断部位の前の P6 から P1、切断部位の後の P1' とラベル付けされています。初期の研究では、プロテアーゼが天然配列に対してどの程度特異性があるかを特徴付けるために、類似の基質のアレイの切断も測定されました。[ 9 ] [ 10 ]
その後の研究では、ランダム化された配列のプールから切断された基質の配列決定を使用して、優先パターンを決定しました。[ 11 ] [ 12 ] ENLYFQ\S が最適な配列ですが、プロテアーゼはさまざまな基質に対して多かれ少なかれ活性を示します (つまり、ある程度の基質非特異性を示します)。最も高い切断は、コンセンサス EXLYΦQ\φ に最も近い配列で、X は任意の残基、Φ は任意の大きなまたは中程度の疎水性、φ は任意の小さな疎水性または極性残基です。この配列は最適ですが、配列の残りの部分が最適であれば、一部の位置に好ましくない残基を持つ配列でも切断される可能性があります。[ 10 ] [ 12 ]
特異性は、酵素と基質の接触面積が大きいことによってもたらされます。トリプシンなどのプロテアーゼは、基質側鎖を結合するポケットが1つか2つしかない浅い結合溝のため、切断される結合の前後の1つの残基に対して特異性を持ちます。一方、TEVプロテアーゼなどのウイルスプロテアーゼは、基質を完全に覆う長いC末端テールを持ち、結合トンネルを形成します。このトンネルには、基質ペプチドの各側鎖（P6からP1'）が相補的な部位（S6からS1'）に結合する一連の強固な結合ポケットが含まれています。[ 5 ]
特に、ペプチド側鎖P6-Gluは3つの水素結合のネットワークと接触し、P5-Asnは溶媒に向かっており、特定の相互作用は形成されない（そのため、この位置では基質コンセンサスが存在しない）。P4-Leuは疎水性ポケットに埋もれており、P3-Tyrは末端に短い水素結合を持つ疎水性ポケットに保持されている。P2-Pheも、三重ヒスチジンの面を含む疎水性部分に囲まれている。P1-Glnは4つの水素結合を形成し、P1'-Serは浅い疎水性溝に部分的にしか囲まれていない。[ 5 ]
このタンパク質の主な用途の1つは、精製された組換え融合タンパク質からアフィニティタグを除去することです。TEVプロテアーゼが生化学的ツールとして使用される理由は、その高い配列特異性です。この特異性により、優先配列が柔軟なループに挿入された場合、タンパク質の制御された切断が可能になります。また、認識される配列はタンパク質中にほとんど存在しないため、TEVプロテアーゼは生体内では比較的毒性が低いものとなります。[ 13 ]
合理的な設計はプロテアーゼの特異性を変えることには限定的な成功しか収めていないが、指向性進化は切断部位の前[ 14 ]または後[ 15 ] [ 16 ]の好ましい残基を変えるために使用されてきた。
最近の進展として、AI誘導による合理的設計、アロステリックネットワーク解析、およびスマート変異誘発の組み合わせを用いて、Numacutと呼ばれる次世代TEVプロテアーゼ変異体が開発されました。この変異体は、ENLYFQ↓Xモチーフにおいて効率的かつ痕跡を残さない切断を示し、P1'位置にはプロリンを除くほぼすべてのアミノ酸が許容されるため、バイオテクノロジーへの応用範囲が大幅に拡大します。[ 17 ]
しかし、TEVプロテアーゼは生化学的ツールとしては限界がある。自己切断（自己分解）による不活性化を起こしやすいが、内部切断部位のS219V変異を1つ導入することでこれを解消できる。[ 18 ]また、単独で発現させたプロテアーゼは溶解性が低いが、指向性進化や計算設計によって溶解性を改善しようとする試みがいくつか行われている。さらに、溶解性向上パートナーとして機能するマルトース結合タンパク質（MBP）との融合によって発現を改善できることも示されている。[ 3 ]
より新しい解決策として、複数の安定化および溶解性向上変異を組み合わせたNumacut変異体が挙げられます。NumacutはE. coliで高収率で発現し、溶解性が大幅に向上し、幅広いpH、塩濃度、緩衝液添加物の範囲で安定性を維持します。野生型酵素とは対照的に、凍結乾燥して室温で保存することも可能であり、工業および製薬分野での応用性を高めています。[ 17 ]
TEVプロテアーゼは4 ℃で活性が10分の1に低下することが報告されている。 [ 19 ] TEVプロテアーゼは34 ℃ 以上の温度で活性が低下する。 [ 20 ]元のTEVプロテアーゼは高い活性を示すために還元剤の存在を必要としたが、これはジスルフィド結合を含むタンパク質の機能に干渉する可能性がある。さまざまな変異が導入された後、後の「スーパーTEVプロテアーゼ」バージョンは還元剤の有無にかかわらず高い活性を示す。[ 21 ] [ 22 ] [ 23 ]
この酵素の分子量は、使用する特定の構造によって25～27kDaの間で変化する。