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テトラマー染色法は、サンプル（血液、脳脊髄液など）中の特定の抗原に特異的なT細胞を検出および定量するためにテトラマータンパク質を使用するフローサイトメトリー法です。 [ 1 ]このアッセイで使用されるテトラマーは、体内のほとんどの細胞の表面に存在する4つの主要組織適合性複合体（MHC）分子で構成されています。 [ 2 ]細胞は、細胞が製造する産物を表示する方法として、ペプチドを含むMHC分子を産生します。MHC提示の重要な機能の1つは、細胞内のウイルス、細菌、癌変異、またはその他の抗原の存在を伝えることです。T細胞受容体がMHC分子によって提示されたペプチドを認識すると、そのT細胞が増殖します。MHCテトラマーは、特定のペプチドを提示するようにバイオエンジニアリングされており、そのペプチドに一致する受容体を持つT細胞を識別するために使用できます。テトラマーは蛍光色素で標識されているため、テトラマーに結合したT細胞をフローサイトメトリーで分析できます。[ 3 ]フローサイトメトリーによるT細胞の定量化と選別により、研究者はウイルス感染やワクチン接種に対する免疫応答や抗原特異的T細胞の機能性を調査することができる。[ 4 ]一般的に、人の免疫系が病原体に遭遇すると、その人はその病原体の特定のペプチドに対する特異性を持つT細胞を持つことになる。病原性ペプチド（例えばインフルエンザAウイルスのヌクレオプロテイン（NP））に特異的なテトラマー染色が陽性であれば、これは被験者におけるインフルエンザAウイルス特異的T細胞の増加を示している。[ 5 ]
この方法は、1996 年にスタンフォード大学の研究室で初めて発表されました。[ 6 ]抗原特異的 T 細胞を定量化する以前の試みでは、精度が低い限界希釈アッセイが用いられており、実際の T 細胞数の 50 ～ 500 分の 1 と推定されていました。[ 7 ] [ 8 ]可溶性 MHCモノマーを用いた染色も、T 細胞受容体と MHC-ペプチドモノマーの結合親和性が低いため、成功しませんでした。MHC テトラマーは、標的 T 細胞上の複数の受容体に結合することができ、その結果、総結合強度が増加し、解離速度が低下します。[ 4 ]
テトラマー染色法は通常、細胞傷害性Tリンパ球（CTL）集団の解析に用いられます。[ 9 ] CTLは、MHCクラスI分子に結合するCD8共受容体を持つため、CD8+ T細胞とも呼ばれます。体内のほとんどの細胞はMHCクラスI分子を発現しており、細胞内抗原の処理と細胞表面への提示を担っています。MHCクラスI分子によって提示されるペプチドが異物である場合（例えば、細胞自身のタンパク質ではなくウイルス性タンパク質由来の場合）、そのペプチドに一致する受容体を持つCTLが細胞を破壊します。[ 2 ]テトラマー染色法は、フローサイトメトリーによるこれらの細胞の可視化、定量化、および選別を可能にし、免疫学において非常に有用です。T細胞集団は、ウイルス感染期間中またはワクチン接種後に追跡することができます。テトラマー染色法は、サンプル中のサイトカイン分泌細胞数を検出するELISpotなどの機能アッセイと組み合わせることもできます。 [ 9 ]
実験室で開発されたMHCテトラマー分子は、細胞上の抗原提示複合体を模倣し、抗原を認識するT細胞に結合することができます。クラスI MHC分子は、多型性重鎖α鎖と不変軽鎖β2ミクログロブリン（β2m）から構成されています。大腸菌を用いて軽鎖と、ビオチン15アミノ酸認識タグを含む短縮型重鎖を合成します。これらのMHC鎖は、酵素BirAでビオチン化され、目的の抗原ペプチドとともに折り畳まれます。ビオチンは、ストレプトアビジンと呼ばれる別のタンパク質と強い結合を形成する小さな分子です。蛍光標識ストレプトアビジンをバイオエンジニアリングされたMHCモノマーに添加すると、ビオチン-ストレプトアビジン相互作用により、4つのMHCモノマーがストレプトアビジンに結合してテトラマーが形成されます。テトラマーを血液サンプルと混合すると、適切な抗原特異的受容体を発現するT細胞に結合します。結合していないMHCテトラマーは、フローサイトメトリーで分析する前にサンプルから洗い流される。[ 9 ]
組換えMHC分子の最近の進歩により、ペプチドMHC複合体の製剤化とそれに続く多量体化が民主化されました。幅広いMHCクラスI分子の高活性製剤[ 10 ]により、専門家でないユーザーでも、特別な装置なしで、どの研究室でも日常的に独自のカスタムペプチド-MHC複合体を作成できるようになりました。
ヘルパー T 細胞に結合するテトラマーも開発されている。[ 9 ]ヘルパー T 細胞または CD4+ T 細胞はCD4共受容体を発現する。これらはクラス II MHC 分子に結合するが、クラス II MHC分子は樹状細胞やマクロファージなどの専門的な抗原提示細胞でのみ発現する。クラス II MHC 分子は細胞外抗原を提示し、ヘルパー T 細胞が細菌、[ 11 ]真菌、寄生虫を検出できるようにする。[ 2 ]クラス II MHC テトラマーの使用はより一般的になってきているが、テトラマーはクラス I テトラマーよりも作成が難しく、ヘルパー T 細胞と MHC 分子間の結合はさらに弱い。[ 9 ] [ 12 ]
ナチュラルキラーT細胞（NKT細胞）もテトラマー技術で可視化できます。NKT細胞は脂質または糖脂質抗原を提示するタンパク質に結合します。[ 13 ] NKT細胞が結合する抗原提示複合体にはCD1タンパク質が含まれているため、CD1で作られたテトラマーを使用してNKT細胞を染色できます。[ 9 ]
テトラマー技術の初期の応用では、 HIV感染に対する細胞性免疫応答に焦点が当てられました。MHCテトラマーはHIV抗原を提示するために開発され、感染患者の血液サンプル中のこれらのHIV抗原に特異的なCTLの割合を調べるために使用されました。これは、細胞傷害性アッセイの結果および血漿RNAウイルス量と比較され、HIV感染におけるCTLの機能が特徴付けられました。テトラマーに結合したCTLは、サイトカイン分泌の分析のためにELIspotウェルに選別されました。[ 14 ]
別の研究では、MHCテトラマー複合体を用いてインフルエンザワクチンの投与方法の有効性を調査した。マウスにインフルエンザワクチンを皮下および鼻腔内投与し、テトラマー染色とフローサイトメトリーを組み合わせて、ワクチンに使用されている抗原に特異的なCTLを定量した。これにより、2つの異なるワクチン投与方法における免疫応答（ウイルスを標的とするT細胞の数）を比較することができた。[ 15 ]