末端制限酵素断片長多型

末端制限断片長多型（TRFLPまたはT-RFLP）は、増幅された遺伝子の標識末端に最も近い制限部位の位置に基づいて微生物群集をプロファイリングする分子生物学技術です。この方法は、1 つ以上の制限酵素を使用して単一遺伝子のPCR増幅変異体の混合物を消化し、 DNA シーケンサーを使用して個々の末端断片のサイズを検出することに基づいています。結果はグラフ画像で、x 軸は断片のサイズを表し、y 軸は蛍光強度を表します。

TRFLPは、未知の微生物群集のフィンガープリントを生成することを目的としたいくつかの分子的方法の1つです。他の同様の方法には、 DGGE、TGGE、ARISA、ARDRA、PLFAなどがあります。 これらの比較的スループットの高い方法は、クローンライブラリ
を使用して微生物群集を分析する際のコストと労力を削減するために開発されました。この方法は、1994年にAvaniss-Aghajaniらによって最初に説明され^[1]、その後1997年にLiuによって説明されました^[2] 。この方法では、いくつかの分離された細菌と環境サンプルのDNAから 16S rDNA標的遺伝子を増幅しました。それ以来、この方法は、機能マーカー遺伝子pmoAなどの他のマーカー遺伝子を使用してメタン資化性群集を分析するために適用されています。

他のほとんどのコミュニティ分析方法と同様に、TRFLP もターゲット遺伝子の PCR 増幅に基づいています。TRFLP の場合、増幅は、5' 末端が蛍光分子で標識されたプライマーの 1 つまたは両方を使用して実行されます。両方のプライマーが標識されている場合は、異なる蛍光染料が必要です。タグ付けの目的で、6-カルボキシフルオレセイン(6-FAM)、ROX、カルボキシテトラメチルローダミン (TAMRA、ローダミンベースの染料)、ヘキサクロロフルオレセイン (HEX) などのいくつかの一般的な蛍光染料を使用できますが、最も広く使用されている染料は 6-FAM です。次に、アンプリコンの混合物は、通常 4 カッター制限酵素を使用して制限反応にかけられます。制限反応の後、DNA シーケンサーでキャピラリーまたはポリアクリルアミド電気泳動を使用して断片の混合物を分離し、さまざまな末端断片のサイズを蛍光検出器で決定します。切り出されたアンプリコンの混合物はシーケンサーで分析されるため、末端フラグメント（つまり、アンプリコンのラベルされた末端）のみが読み取られ、他のフラグメントはすべて無視されます。したがって、T-RFLP は、すべての制限フラグメントが視覚化される ARDRA およびRFLPとは異なります。これらの手順に加えて、TRFLP プロトコルには、制限の前に PCR 産物のクリーンアップが含まれることが多く、キャピラリー電気泳動を使用する場合は、サンプルを実行する前に脱塩段階も実行されます。

T-RFLP プロファイリングの結果は、電気泳動実験 (ゲルまたはキャピラリー)の強度プロット表現である電気泳動図と呼ばれるグラフです。電気泳動図では、X 軸はフラグメントのサイズを示し、Y 軸は各フラグメントの蛍光強度を示します。したがって、電気泳動ゲル上にバンドとして現れるものは、その積分が総蛍光である電気泳動図上のピークとして現れます。T-RFLP プロファイルでは、各ピークは元のサンプル内の 1 つの遺伝子変異に対応し、その高さまたは面積は特定のコミュニティ内の相対的な存在量に対応します。ただし、上記の両方の仮定が常に満たされるわけではありません。多くの場合、集団内の複数の異なる細菌は、実験で使用された特定の制限酵素の制限部位が同じ位置に存在するため、電気泳動図上で 1 つのピークを示すことがあります。この問題を克服し、この手法の分解能を高めるために、1 つのサンプルを複数の酵素 (多くの場合 3 つ) で並行して消化し、サンプルごとに 3 つの T-RFLP プロファイルを作成し、それぞれが一部の変異を解決し、他の変異を見逃します。時々使用される別の変更は、異なる染料を使用してリバースプライマーも蛍光標識することです。これにより、サンプルごとに 2 つの並列プロファイルが生成され、それぞれが異なる数の変異を解決します。

2 つの異なる遺伝子変異が 1 つのピークに収束することに加えて、主に偽ピークの形でアーティファクトが現れることもあります。偽ピークには通常、バックグラウンド「ノイズ」と「疑似」TRF の 2 種類があります。^[3]バックグラウンド (ノイズ) ピークは、使用中の検出器の感度から生じるピークです。これらのピークは強度が小さいことが多く、通常、プロファイルの合計強度が低い場合 (つまり、DNA の濃度が低い場合) に問題になります。これらのピークはバックグラウンド ノイズから生じるため、通常は複製プロファイルで再現できません。そのため、この問題は、複数の複製からコンセンサス プロファイルを作成するか、特定のしきい値を下回るピークを除去することで対処できます。この問題に対処するために、他の計算手法もいくつか導入されました。^[4]一方、疑似 TRF は再現可能なピークであり、ロードされた DNA の量に比例します。これらのピークは、ssDNA が自己アニーリングして二本鎖のランダムな制限部位を生成した結果であると考えられており、これが後に制限酵素によって認識され、真の遺伝子変異を表さない末端断片が生成されます。消化段階の前に緑豆エキソヌクレアーゼなどの DNAエキソヌクレアーゼを適用すると、このようなアーティファクトが除去される可能性があると考えられています。

電気泳動図から得られるデータは、通常、次のいずれかの方法で解釈されます。

パターン比較では、異なるサンプルの電気泳動図の一般的な形状を比較して、処理間のピークの有無、それらの相対的なサイズなどの変化を調べます。

T-RFLP 分析と並行してクローン ライブラリを構築すると、クローンを使用して T-RFLP プロファイルを評価および解釈できます。この方法では、各クローンの TRF は直接 (つまり、各単一クローンに対して T-RFLP 分析を実行する) またはクローンの配列のin silico分析によって決定されます。T-RFLP プロファイルをクローン ライブラリと比較することで、各ピークが本物であることを検証できるだけでなく、ライブラリ内の各変異体の相対的な豊富さを評価することもできます。

いくつかのコンピュータ アプリケーションは、電気泳動図のピークをデータベース内の特定の細菌に関連付けようとします。通常、このタイプの分析は、異なる制限酵素で取得した単一のサンプルの複数のプロファイルを同時に解析することによって行われます。次に、ソフトウェアは、プロファイルのピークとデータベースのエントリ間の一致を最大化しようとしてプロファイルを解析し、一致するシーケンスのないピークの数が最小限になるようにします。ソフトウェアは、分析されたすべてのプロファイルに TRF があるシーケンスのみをデータベースから削除します。

T-RFLPプロファイルを分析する方法として最近増えているのが、多変量統計手法を使用してT-RFLPデータを解釈する方法です。^[5]通常、適用される手法は、生態学、特に生物多様性の研究で一般的に使用されているものです。その中でも、順位付けとクラスター分析が最も広く使用されています。T-RFLPデータに対して多変量統計分析を実行するには、まずデータを「種別サンプル表」と呼ばれる表に変換する必要があります。この表は、さまざまなサンプル（T-RFLPプロファイル）と種（T-RFS）を、ピークの高さまたは面積を値として表します。

T-RFLP はフィンガープリンティング技術であるため、その利点と欠点は、主に DGGE などの他の同様の技術と比較して議論されることがよくあります。

T-RFLP の主な利点は、自動シーケンサーを使用することで、繰り返しサンプルに対して非常に再現性の高い結果が得られることです。遺伝子プロファイルは完全には再現できず、出現するいくつかの小さなピークは再現不可能ですが、電気泳動図の全体的な形状と主要なピークの比率は再現可能と考えられます。結果をデジタル数値形式で出力する自動シーケンサーを使用すると、データを簡単に保存し、さまざまなサンプルや実験を比較することもできます。データの数値形式は、相対的 (絶対的ではない) な定量化と統計分析に使用でき、実際に使用されています。T-RFLP プロファイルから直接シーケンス データを明確に推測することはできませんが、ピークを既存のシーケンスに割り当てることは、ある程度可能です。

T-RFLP は DNA 抽出法と PCR に依存しているため、両方に固有のバイアスが分析結果に影響します。^{[6] [7]}また、末端フラグメントのみが読み取られるということは、末端制限部位を共有する 2 つの異なる配列は、電気泳動図上で 1 つのピークのみになり、区別がつかないことを意味します。実際、T-RFLP を複雑な微生物群集に適用すると、全体の多様性が圧縮され、通常 20～50 の異なるピークになり、それぞれが未知の数の異なる配列を表すだけになります。この現象により T-RFLP の結果が扱いやすくなりますが、当然のことながら、実際の多様性のバイアスと単純化が生じます。この問題を最小限に抑える (ただし克服しない) 試みは、複数の制限酵素を適用したり、両方のプライマーを異なる蛍光色素でラベル付けしたりすることでよく行われます。T-RFLP から配列を取得できないと、T-RFLP 分析と並行して 1 つ以上のクローン ライブラリを構築して分析する必要が生じることが多く、労力が加わり、分析が複雑になります。上で説明したように、偽の（疑似）T-RF が出現する可能性があることも、もう 1 つの欠点です。この問題に対処するために、研究者はクローン ライブラリ内のシーケンスに関連付けられるピークのみを考慮することがよくあります。

• キャピラリー電気泳動による T-RFLP の改良プロトコル
• 16S rRNA 遺伝子の末端制限酵素断片長多型の分析による微生物群集の多様性を特徴付ける統計的手法。
• FragSort: オハイオ州立大学の T-RFLP プロファイルの「in-silico」割り当て用ソフトウェア。
• T-RFLP 分析 (APLAUS+): アイダホ大学の微生物コミュニティ分析プロジェクトの Web サイトにあるもう 1 つの「in-silico」割り当てツール
• [1]: BEsTRF: ユーザー定義のプライマー酵素配列データベースに基づく末端制限酵素断片長多型解析の最適解を求めるツール
• [2]: 微生物生態学における末端制限断片長多型（T-RFLP）の最初の10年