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空間トランスクリプトミクスは、無傷の組織内の転写活性の位置的コンテキストを捉える方法であり、空間生物学の重要な部分を構成しています。最近の研究では、例えば核内のmRNA分子の細胞内局在も研究できることが実証されています。[1]
最初に広く採用された方法は、Ståhlらが2016年にScience誌に発表した画期的な論文[2]で説明しており、ポリアデニル化mRNAを捕捉するために、空間的にバーコード化されたオリゴ(dT)テールの「スポット」を含むガラススライドまたはアレイ上に個々の組織サンプルを配置することを示唆している。[2]アレイ化されたスライド上のxおよびy位置を示すオリゴ(dT)テールおよび空間バーコードの他に、プローブには増幅およびシーケンシングハンドル、および固有の分子識別子が含まれている。[2]通常、組織学的サンプルはクライオトームを使用して切り取られ、固定、染色され、マイクロアレイ上に配置される。[2]その後、酵素透過処理が行われ、RNA分子がスライドまで拡散し、ポリアデニル化mRNA分子がオリゴ(dT)プローブにさらにハイブリダイズする。[2]次に、逆転写がin situで実行される。[2]その結果、空間的にマークされた相補的DNA（cDNA）が合成され、サンプルの正確な位置における遺伝子発現に関する情報が提供されます。[2] cDNAから、ショートリードシーケンシング用のライブラリが合成されます。要約すると、最初に広く採用された空間トランスクリプトミクスプロトコルは、同じサンプルの並列シーケンシングと染色を組み合わせたものです。[2]下流の分析では、バイオインフォマティクスツールを使用して、組織画像と遺伝子発現を重ね合わせることができます。出力は、組織切片内の個々の細胞の遺伝子発現を捉えたトランスクリプトームのマップです。アレイ化されたスライドの第1世代は、直径100μmのスポット約1,000個で構成され、解像度がスポットあたり約10〜40個の細胞に制限されていたことに言及することが重要です。[2]
空間トランスクリプトミクスには、遺伝子検出のための次世代シーケンシングに基づく方法と、イメージングに基づく方法の2つの方法に分けられる。[3]転写産物の空間分布を解明するための一般的なアプローチには、マイクロダイセクション技術、蛍光in situハイブリダイゼーション法、in situシーケンシング、in situキャプチャプロトコル、in silicoアプローチなどがある。[4]
アプリケーション
mRNA分子の空間分布を定義することで、組織、腫瘍、免疫細胞における細胞の不均一性を検出できるほか、さまざまな条件での転写産物の細胞内分布を判定できます。[4]この情報は、組織と個々の細胞の両方で細胞と細胞内の構造を解読するユニークな機会を提供します。これらの方法論は、発生学、腫瘍学、免疫学、組織学の分野で重要な洞察を提供します。[4]多細胞生物の個々の細胞の機能は、体内の正確な位置を特定することによってのみ完全に説明できます。[4]空間トランスクリプトミクス技術は、このようにして細胞の特性を解明しようとしました。以下では、遺伝子発現と細胞の空間的構成を結び付ける方法について説明します。[4]
顕微解剖
レーザーキャプチャーマイクロダイセクション
レーザーキャプチャーマイクロダイセクションは、形態学的変化を引き起こすことなく単一細胞を捕獲することを可能にする。[6] [7]この方法は、組織切片に重ねた透明なエチレンビニルアセテートフィルムと低出力赤外線レーザービームを利用する。[6]このようなビームが目的の細胞に向けられると、標的領域の真上にあるフィルムが一時的に溶け、長鎖ポリマーが細胞を覆い、しっかりと捕獲する。[6]次に、切片を取り除き、目的の細胞はフィルムに埋め込まれたままになる。[6]この方法により、回収した細胞のさらなるRNA転写産物プロファイリングとcDNAライブラリ生成が可能になる。
個々の凍結切片のRNA配列決定
個々の凍結切片における選択された領域のRNAシーケンシングは、位置ベースのゲノム全体の発現データを生成することができる別の方法です。[8]この方法は、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションなしで実行されます。この方法は、凍結切片化されたショウジョウバエの胚における遺伝子発現のゲノム全体の空間パターンを決定するために最初に使用されました。[8]本質的には、サンプルの選択された領域からライブラリを簡単に準備することを意味します。この方法では、各スライスの総RNAの量が少ないために材料が失われるため、すべてのセクションから高品質のRNA-seqライブラリを取得することが困難でした。[4] [8]この問題は、最初のRNA抽出後に遠縁のショウジョウバエ種のRNAを各チューブに追加することで解決されました。[8]
ティヴァ
トランスクリプトームインビボ分析( TIVA )は、生きた組織切片内の生きた単一細胞から mRNA を捕捉できる技術です。[9]この技術では、光活性化タグを使用します。[4] [9] TIVA タグには、いくつかの官能基と、ビオチンに結合した捕捉されたポリ (U) オリゴヌクレオチドがあります。[9]タグに隣接するジスルフィド結合ペプチドにより、タグは細胞膜を貫通できます。[9]細胞内に入ると、レーザー光活性化を使用して、目的の細胞内のポリ (U) オリゴヌクレオチドのブロックを解除し、TIVA タグが細胞内の mRNA とハイブリダイズします。[9]次に、ビオチン基のストレプトアビジン捕捉を使用して、ブロック解除されたタグに結合したポリ (A) テール mRNA 分子を抽出し、その後、これらの mRNA を RNA シーケンシングで分析します。[9]この方法は、一度に処理できる単一細胞が少数であるため、スループットが低いという制限があります。[4]
トモシーケンス
上述の個々の凍結切片のRNAシーケンシングの高度な代替手段であるRNAトモグラフィー（tomo-seq）は、より優れたRNA定量化と空間分解能を特徴としています。 [10]これはまた、組織の凍結切片化に基づいており、個々の切片のRNAシーケンシングをさらに行うことで、ゲノム全体の発現データが得られ、空間情報が保存されます。 [10]このプロトコルでは、個々の組織切片でのcDNAの線形増幅のため、キャリアRNAの使用は省略されています。[10]同一のサンプルを異なる方向に切片化し、その後、重複データを使用して3D転写構築を行います。[10]全体として、この方法では各切片に同一のサンプルを使用するため、臨床材料の処理には適用できません。[4]
LCMシーケンス
LCM-seqは、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）とSmart-Seq2 RNAシーケンシングを組み合わせて使用し、単一細胞レベルまで適用でき、部分的に分解された組織にも使用できます。ワークフローには、組織の凍結切片化とそれに続くレーザーキャプチャーマイクロダイセクションが含まれます。レーザーキャプチャーマイクロダイセクションでは、細胞が溶解バッファーに直接収集され、RNAを分離する必要なくcDNAが生成されるため、実験手順が簡素化され、技術的なノイズが低減します。[11] [12] LCM手順中に各細胞の位置のアイデンティティが記録されるため、対応するcDNAライブラリのRNAシーケンシング後の各細胞のトランスクリプトームは、分離された位置を推測できます。[11] LCM-seqは、眼球運動ニューロン、顔面運動ニューロン、舌下運動ニューロン、脊髄運動ニューロン、赤核ニューロン、[13]介在ニューロン、[14]ドーパミンニューロン、[15]軟骨細胞など、複数の細胞タイプに適用され、それらの固有の特性の理解に役立っています。[16]
ジオシーケンス
Geo-seqは、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションとシングルセルRNAシーケンシングの両方の手順を利用して、約10個の細胞の大きさの組織領域におけるトランスクリプトームの空間分布を決定する方法です。[17]ワークフローでは、組織の除去と凍結切片化の後にレーザーキャプチャーマイクロダイセクションが行われます。[17] [18]次に、抽出された組織を溶解し、RNAを精製してcDNAライブラリーに逆転写します。[17] [18]ライブラリーを配列決定し、トランスクリプトームプロファイルを抽出された組織の元の場所にマッピングできます。[17] [18]この技術により、ユーザーは組織内の関心領域を定義し、その組織を抽出し、ターゲットを絞ったアプローチでトランスクリプトームをマッピングすることができます。
NICHE-seq
NICHE-seq法では、光活性化蛍光マーカーと2光子レーザー走査顕微鏡を使用して、生成されたトランスクリプトームに空間データを提供します。[19]蛍光マーカーに結合した細胞は光活性化され、解離し、蛍光活性化細胞選別によって選別されます。[19]これにより、ラベル付けされた光活性化細胞のみに選別特異性が与えられます。[19]選別後、単一細胞RNAシーケンシングにより、視覚化された細胞のトランスクリプトームが生成されます。 [19]この方法では、定義されたニッチ内の何千もの細胞を処理できますが、ニッチ内の細胞間の空間データが失われます。 [ 19 ]
プロキシムID
ProximIDは、抽出された組織を単一細胞に反復的にマイクロ消化する手法です。[20]最初の軽度の消化ステップでは、継続的な消化の前に記録された小さな相互作用構造が保存されます。[20]次に、単一細胞を各構造から分離し、sc-RNAseqを実行し、t分布の確率的近傍埋め込みを使用してクラスター化します。[20] [21]クラスター化された細胞は、マイクロ消化前の相互作用構造に基づいて、物理的な相互作用にマッピングできます。[20]この技術のスループットは比較的低いですが、細胞間の物理的な相互作用に関する情報をデータセットに提供します。[4]
蛍光現地で交配
ナノストリングCosMx
CosMx 空間分子イメージング装置は、細胞および細胞内解像度でホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) および新鮮凍結 (FF) 組織サンプルの空間マルチオミクスを提供する初のハイプレックス in situ 分析プラットフォームです。最大 1,000 個の RNA と 64 個の検証済みタンパク質分析物の迅速な定量化と視覚化が可能で、細胞アトラス、組織表現型解析、細胞間相互作用、細胞プロセス、バイオマーカーの発見のための柔軟な空間単一細胞イメージング プラットフォームです。
smFISH
個々の細胞の空間的に分解されたRNAプロファイリングを達成できる最初の技術の1つは、単分子蛍光in situハイブリダイゼーション（smFISH）でした。[ 22 ]これは、5つの蛍光体と結合した短い（50塩基対）オリゴヌクレオチドプローブを実装し、特定の転写産物に結合してサンプルに明るいスポットを生成します。[22]これらのスポットを検出することで、細胞内の特定の遺伝子の発現に関する定量的な情報が得られます。[22]しかし、複数の蛍光体で標識されたプローブの使用は、自己消光、ハイブリダイゼーション特性の変化、それらの合成と精製によって課題がありました。[4]
その後、この方法は変更され[23]、上記のプローブを、1つの蛍光体のみに結合し、目的のmRNA配列と相補的な20bp長のプローブに置き換えました。つまり、これらが集合的に標的mRNAに結合することになります。このようなプローブ1つ自体は強い信号を生成しませんが、集合したプローブの累積蛍光は明るいスポットを示します。単一のミスバウンドプローブが共局在する可能性は低いため、この方法では偽陽性信号は限られています。[4]
したがって、このin situハイブリダイゼーション (ISH) 技術は、単一細胞内の個々の RNA 分子を直接イメージングすることにより、RNA 発現の空間的局在を特定します。
RNAスコープ
RNAscopeと呼ばれる別のin situハイブリダイゼーション技術は、特定のZ字型デザインのプローブを使用して、ハイブリダイゼーションシグナルを同時に増幅し、バックグラウンドノイズを抑えます。[24]これにより、さまざまな種類の細胞内の単一のRNAを視覚化できます。[25] RNAScopeのほとんどのステップは、従来のISHプロトコルに似ています。[24]組織サンプルはスライドに固定され、細胞に浸透するRNAscope試薬で処理されます。 Zプローブは、ターゲット配列にペアで結合した場合にのみ効果を発揮するように設計されています。[24]これにより、この方法の別の要素（プリアンプ）をZプローブの上部テールに接続できます。[24]プリアンプは固定されると、他の要素（アンプ）の結合部位として機能し、アンプは別のタイプのプローブ（ラベルプローブ）に結合します。[24]その結果、ターゲット配列上にかさばった構造が形成されます。最も重要なのは、プリアンプが単一のZプローブに結合しないため、非特異的結合によって信号放出が起こらず、冒頭で述べたバックグラウンドノイズが排除されることです。[4] [24]
シーケンスFISH
連続蛍光in situハイブリダイゼーション （seqFISH）は、空間的コンテキストを保存しながら単一細胞内でmRNAを直接識別する別の方法です。[26] [27]この方法は複数のラウンドで実行され、それぞれに蛍光プローブのハイブリダイゼーション、イメージング、および連続プローブストリッピングが含まれます。[26]さまざまな遺伝子に各ラウンドで異なる色が割り当てられ、一意の時間バーコードが生成されます。[26]このように、seqFISHは赤-赤-緑などの連続カラーコードでmRNAを区別します。 ただし、この技術には、自己蛍光背景と、各ラウンドで使用されるプローブの数による高コストという欠点があります。[4]
マーフィッシュ
従来のFISH法は、異なるカラーチャネルの数が少ないため、同時に分析できる遺伝子の数が少ないという制限がありましたが、この問題を克服するために、多重エラーロバストFISHが設計されました。[28] 多重エラーロバストFISH （MERFISH）は、複数回のハイブリダイゼーションでバイナリコード遺伝子ラベリングを採用することで、単一細胞で同時に画像化できるRNA種の数を大幅に増やします。 [ 29 ]このアプローチは、エラーを検出して修正するエンコード方式を使用して、一度に140種のRNA種を測定できます。 [29]基本原理は、連続する複数のハイブリダイゼーションラウンドからの信号を組み合わせ、対象の遺伝子にNビットのバイナリバーコードを割り当てることで遺伝子を識別することにあります。[29]コードは特定のプローブに依存し、「1」または「0」の値で構成され、その組み合わせは遺伝子ごとに異なります。[29]エラーは、6ビット以上のコードを使用し、そのうちの2つが少なくとも3ビット異なるようにすることで回避されます。[29]各RNA種に対して特異的なプローブが作成されます。[29]各プローブは、20〜30塩基対からなる標的特異的オリゴヌクレオチドであり、細胞に浸透した後にmRNA配列に相補的に結合します。[29]次に、次のように複数ラウンドのハイブリダイゼーションが実行されます。各ラウンドでは、対応するバイナリコードの位置に「1」を含むプローブのみが追加されます。[29]各ラウンドの最後に、蛍光顕微鏡を使用して各プローブの位置を特定します。[29]予想どおり、割り当てられた位置に「1」があるmRNAのみがキャプチャされます。[29]次に、写真を光退色させ、新しいサブセットを追加します。[29]このようにして、多数のRNA種を区別することを可能にするバイナリ値の組み合わせを取得します。
smHCR
ハイブリダイゼーション連鎖反応による深部での単一分子RNA検出（smHCR）は、厚くて不透明な組織サンプルにおける自己蛍光バックグラウンドの典型的な問題を克服できる高度なseqFISH技術です。[ 30]この方法では、複数の読み取りプローブがmRNAのターゲット領域に結合します。[30]ターゲットは、定義されたサブシーケンスでそれに結合する一連の短いDNAプローブによって検出されます。[30]各DNAプローブは、同じHCRアンプの開始剤を運びます。[30]次に、蛍光体で標識されたDNA HCRヘアピンがサンプルに浸透し、開始プローブに結合する蛍光増幅ポリマーに組み立てられます。[30]マルチプレックス研究では、上記と同じ2段階プロトコルが使用されます。すべてのプローブセットは、すべてのHCRアンプと同様に同時に導入され、スペクトル的に異なる蛍光体がさらなるイメージングに使用されます。[30]
osm魚類
サイクリックウロボロスsmFISH ( osmFISH) は、光学的混雑の課題を克服することを目的とした smFISH の改良版です。[31] osmFISH では、転写産物が可視化され、プローブが除去される前に画像が取得され、新しい転写産物が別の蛍光プローブで可視化されます。[31]連続したラウンドの後、画像は RNA の空間分布を表示するためにコンパイルされます。[31]転写産物が順次可視化されるため、信号が互いに干渉する問題が排除されます。[4] [31]この方法により、ユーザーは他の関連技術よりも大きな組織切片の高解像度画像を生成できます。[4]
元魚類
拡張FISH（ExFISH）は、拡張顕微鏡を利用して、脳組織のような厚い標本でもRNAの位置を超解像で画像化することを可能にする。[32]単一分子と多重分子の両方の読み出しをサポートする。[32]
イージーフィッシュ
拡張支援反復蛍光in situハイブリダイゼーション（EASI-FISH）は、ExFISHを最適化し、これまで可能だったよりも厚い（300μm）サンプルに対する検出精度と堅牢なマルチラウンド処理を向上させました。[33]また、ターンキー計算分析パイプラインも含まれています。[34]
シーケンスFISH+
SeqFISH+は、後続の蛍光による空間的な混雑に関連する光学的問題を解決しました。[35]まず、一次プローブが標的mRNAにアニールし、その後、後続のプローブが一次プローブの隣接領域に結合して、固有のバーコードが生成されます。[35]各読み出しプローブは画像としてキャプチャされ、超解像画像にまとめられます。[35]この方法により、ユーザーは一度に最大1万個の遺伝子をターゲットにすることができます。[4]
DNA顕微鏡
DNA顕微鏡法は、光学を使わずに分子の位置をマッピングし、複数の連続したin situ反応で実行される配列データを同時に保存するための独自の画像化方法です。 [36]まず、細胞を固定し、cDNAを合成します。[36]次に、ランダム化されたヌクレオチドがin situでターゲットcDNAにタグ付けされ、各分子に固有のラベルが提供されます。[ 36] タグ付けされた転写産物は2番目のin situ反応で増幅され、取得されたコピーが連結され、新しいランダム化されたヌクレオチドが追加されます。[36]連続する各連結イベントにラベルが付けられ、固有のイベント識別子が生成されます。[36]次に、アルゴリズムは、得られた連結配列からデコードされた分子近接性に基づいて元の転写産物の画像を生成すると同時に、ターゲットの単一ヌクレオチド情報も記録されます。[36]
現地でシーケンス
南京錠プローブを使用するISS
ISSパドロック法[37]は、パドロックプロービング、[38]、ローリングサークル増幅（RCA）[39] 、およびライゲーション化学によるシーケンシングに基づいています。[40]無傷の組織切片内で、mRNAはcDNAに逆転写され、続いてRNase HによってmRNAが分解されます。[4]次に、この方法を実行するには2つの方法があります。1つ目の方法であるギャップターゲットシーケンシングでは、ライゲーションによるシーケンシングのターゲットとなるプローブの両端の間にギャップがある状態でパドロックプローブがcDNAに結合します。[4]次に、DNA重合によってこのギャップが埋められ、DNAライゲーションによってDNAサークルが作成されます。[4]もう1つの方法であるバーコードターゲットシーケンシングでは、バーコード配列を持つパドロックプローブのDNA環状化がライゲーションのみで行われます。[4]両方のバージョンの方法では、両端がライゲーションされてDNAの環状が形成されます。[4]次に、RCAによってターゲット増幅が行われ、マイクロメートルサイズのRCA製品（RCP）が生成されます。[4] RCAは、南京錠プローブ配列の繰り返しで構成されています。[4]これらのDNA分子は、バージョンに応じて、ギャップ充填配列または隣接する端を持つプローブ内の最大4塩基長のバーコードのいずれかをデコードするライゲーションによるシーケンシングにかけられます。[4]ギャップのないバリアントはより高い感度を主張し、ギャップ充填バリアントは転写物の実際のRNA配列を読み取ることを意味します。 [4]その後、この方法は、マイクロ流体プラットフォームでの自動化と、ライゲーションによるシーケンシングをハイブリダイゼーションによるシーケンシングに置き換えることで改善されました。[4]
フィセック
蛍光in situシーケンシング（FISSEQ）[41]は、 ISS南京錠と同様に、逆転写、ローリングサークル増幅、ライゲーション技術によるシーケンシングを使用する方法です。[4]これにより、固定細胞での空間トランスクリプトーム解析が可能になります。[4] RNAは最初に、通常および修飾アミン塩基とタグ付けされたランダムヘキサマーRTプライマーを使用してcDNAに逆転写されます。[4]アミン塩基は、cDNAとその細胞周囲への架橋を媒介します。[4]次に、cDNAはライゲーションによって循環され、RCAによって増幅されます。[4]その結果、直径200〜400 nmの一本鎖DNAナノボールが得られます。[4]したがって、これらのナノボールは、cDNA配列の多数のタンデムリピートから構成されます。次に、ライゲーションによるSOLiDシーケンシングを介してシーケンシングが実行されます。[4]逆転写産物とクローン増幅されたRCPの両方の位置は、前述の細胞マトリックス成分への架橋を介して維持され、細胞内に3D in situ RNA-seqライブラリを作成します。 [4]異なる色の蛍光プローブと結合すると、アンプリコンは蛍光性が高くなり、信号を視覚的に検出できますが、画像処理アルゴリズムは信号強度ではなく、参照配列への読み取りアライメントに依存しています。[4]
バリスタシーケンス
バーコードインサイチュー標的 シーケンシング（Barista-seq）は、ギャップパドロックプローブ法の改良版で、効率が5倍向上し、読み取り長が15塩基に増加し、イルミナのシーケンシングプラットフォームと互換性があります。[ 4 ] [ 21]この方法でもパドロックプローブとローリングサークル増幅が使用されますが、このアプローチではギャップパドロック法とは異なり、合成によるシーケンシングと架橋が使用されます。[21]同じ手順での細胞マトリックスへの架橋は、FISSEQと同じです。[4] [21]
スターマップ
STARmap（空間分解転写産物読み出しマッピング）は、南京錠型プローブと追加のプライマーを使用して、mRNAを直接増幅し、逆転写の必要性を排除します。[ 4] [ 42]他の南京錠型プローブベースの方法と同様に、増幅はローリングサークル増幅によって行われます。[4] DNAアンプリコンは化学的に修飾され、細胞内の重合ハイドロゲルに埋め込まれます。[4]捕捉されたRNAは、各細胞内のmRNAの3次元位置を提供するその場で配列決定できます。 [4]
現地で捕獲
ステレオシーケンス(STOmics)
STOmicsは、独自のSpaTial Enhanced REsolution Omics-Sequencing（Stereo-seq）技術を通じて、空間的に分解されたトランスクリプトーム解析を進歩させた先駆者です。[43] これは、in situキャプチャとDNB-seqを組み合わせたもので、DNBシーケンシングは、in situシーケンシング用のリソグラフィでエッチングされたチップ（パターン化されたアレイ）に基づいています。他のμmレベルのin situキャプチャ技術とは異なり、標準的なDNBチップには、直径約220nm、中心間距離500nmのスポットがあり、10mmの直線距離あたり最大20000個の組織RNAキャプチャスポット、または1cm 2あたり4x10 8個のスポットを提供します。したがって、STOmicsは、他のin situキャプチャ技術よりも高い解像度と広い視野を示すことができます。[44]
空間トランスクリプトミクス
空間トランスクリプトミクスは、領域または単一細胞のいずれかについて、無傷の組織内の転写活動の位置的コンテキストを捕捉する能力です。
組織凍結切片を空間トランスクリプトームスライドに取り付けると、バーコードプライマーが結合して組織から隣接する mRNA を捕捉します。組織切片がスライドに取り付けられている間に、捕捉された mRNA の逆転写が開始され、結果として得られるcDNAにプライマーの空間バーコードが組み込まれます。mRNA の捕捉と逆転写の後、シーケンスライブラリが準備され、イルミナ ダイ シーケンスで分析されます。生成された各シーケンス内に存在する空間バーコードにより、個々の mRNA 転写物のデータを組織切片内のその発生点にマッピングできます。
ナノストリング GeoMx
NanoString のGeoMx デジタル空間プロファイラー (DSP) では、インサイチューハイブリダイゼーションプローブに組み込まれた UV 光分解バーコードにより、FFPE または凍結組織スライド上の顕微鏡的関心領域を定義することができます。[4] [45]関心領域は UV 光に特異的にさらさ、バーコードが切断され、組織内に存在する RNA またはタンパク質を識別するために使用されます。[45]定義された関心領域のサイズは 10 〜 600 マイクロメートルの範囲で変化し、組織学的サンプル内のさまざまな構造や細胞をターゲットにすることができます。[4]
スライドシーケンス
スライドシークエンスは、RNA結合性DNAバーコードマイクロビーズをゴムコーティングされたガラスカバーガラスに付着させることによって行われます。[4] [46]マイクロビーズはSOLiDシークエンシングによって空間位置にマッピングされます。[46]組織切片をこのカバーガラスに移して抽出したRNAを捕捉します。捕捉されたRNAは増幅され、配列決定されます。[46]転写産物の局在は、それを捕捉したビーズからのバーコードオリゴヌクレオチド配列によって決定されます。[46]
APEXシーケンス
APEX-seqは、細胞の異なる領域における空間トランスクリプトームの評価を可能にする。[4] [47]この方法は、ビオチンフェノールおよび過酸化水素とともにインキュベートされた生細胞で発現するAPEX2遺伝子を利用する。[47]これらの条件下では、APEX2酵素はビオチン基のRNA分子への転移を触媒し、これらはストレプトアビジンビーズ精製によって精製することができる。[47]次に、精製された転写産物を配列決定し、どの分子がビオチンタグ付け酵素に近接していたかを決定する。[47]
標準時
高解像度空間トランスクリプトミクス（HDST）は、スライドガラス上のウェル内のmRNAキャプチャビーズの位置を解読することから始まります。[48]これは、各ビーズのバーコードオリゴヌクレオチド配列への順次ハイブリダイゼーションによって達成されます。[48]各ビーズの位置が解読されると、組織サンプルをスライド上に置いて透過処理することができます。[48]次に、キャプチャされた転写産物を配列します。[48] HDSTはSlide-seqよりも小さなビーズを使用するため、Slide-seqの10マイクロメートルと比較して2マイクロメートルの空間分解能で解析できます。[4]
10X ゲノミクス ビジョン
10X Genomics Visium アッセイは、空間トランスクリプトミクス アッセイのより新しく改良されたバージョンです。このアッセイも、ガラス スライドの表面にスポットされた mRNA 捕捉プローブのアレイを利用しますが、スポット数が増え、スポット サイズが最小化され、スポットあたりの捕捉プローブの量が増えています。Visium 空間遺伝子発現スライドの 4 つの捕捉エリアのそれぞれには、約 5000 個のバーコード スポットがあり、その中には数百万個の空間的にバーコードされた捕捉オリゴヌクレオチドが含まれています。組織 mRNA は透過処理によって放出され、バーコード オリゴに結合して遺伝子発現情報を捕捉できます。各バーコード スポットの直径は 55 μm で、1 つのスポットの中心から別のスポットの中心までの距離は約 100 μm です。スポットは互い違いに配置され、スポット間の距離が最小限に抑えられています。平均して、スポットごとに 1 から 10 個の細胞からの mRNA が捕捉され、ほぼ単一細胞の解像度が得られます。 [49]
キュリオバイオSEEKER
Curio Bio SEEKER アッセイは、10X Genomics Visium と概念が似ていますが、スポットの密度が高くなっています。ヒトやマウスなどの種に対して事前に定義する必要がある RNA プローブを使用する 10X Genomics Visium HD とは異なり、SEEKER は同様の密度と解像度を持ちますが、サンプル内のすべての mRNA のポリ A 適応を使用して、任意の新鮮な凍結組織サンプルをアッセイします。
コンピュータによる工事
ISHを用いた再構築
ISH によるin silico空間再構成は、細胞の位置をその発現プロファイルに従って計算的に空間再構成することを意味します。[4]この原理には、いくつかの類似した方法があります。[50] [51]これらは、単一細胞トランスクリプトミクスと、同じ細胞タイプの利用可能な ISH ベースの遺伝子発現アトラスを共同分析します。[4]これらのデータに基づいて、細胞は組織内の位置に割り当てられます。明らかに、この方法は ISH 参照の可用性という要因によって制限されます。[4]さらに、複雑な組織内の細胞を割り当てる場合は、より複雑になります。このアプローチは、ペアの参照がないため、臨床サンプルには適用できません。[4]脳組織内の細胞の正確な割り当ての成功率は 81% と報告されています。[50]
分布マップ
Distmapアルゴリズムを使用してトランスクリプトームをマッピングするには、高スループットの単一細胞シーケンシングと、対象組織の既存のin situハイブリダイゼーションアトラスが必要です。[4] [52] Distmapアルゴリズムは、シーケンシングされた細胞のトランスクリプトームと上記の参照アトラスを使用して、対象組織の仮想3Dモデルを生成します。[4] [52]トランスクリプトームは、t分布の確率的近傍埋め込みを使用して細胞タイプにクラスター化し、仮想in situハイブリダイゼーションを使用して3Dモデルにマッピングできます。[52] [53]基本的に、このアルゴリズムは、解離した組織内の単一細胞から生成されたデータを取得し、仮想in situハイブリダイゼーションを使用して、個々のトランスクリプトを組織内の細胞タイプが存在する場所にマッピングできます。
歴史
in situハイブリダイゼーションは60年代後半に開発され、80年代（smFISH）と10年代（RNAscope、seqFISH、MERFISH、osmFISH）に大きな進歩が見られ、最近ではseqFISH+とDNA顕微鏡法が追加されました。[17]マイクロダイセクション技術は90年代後半に初めて開発され（レーザーキャプチャーマイクロダイセクション）、最も最近追加されたのは2016年のProximIDの開発です。[4]空間ゲノミクス/トランスクリプトミクスという技術は、2000年にマイケル・ドイル（エオラス社）、モーリス・ペシテッリ（イリノイ大学シカゴ校）、ベッツィ・ウィリアムズ（ハーバード大学）、ジョージ・マイケルズ（ジョージ・メイソン大学）によって発明され、開発された。[54] [55] [56]可視胚プロジェクトの一環として[57] [58]その後、2016年にスウェーデンのストックホルムでヨナス・フリゼン、ヨアキム・ルンデバーグ、パトリック・シュタールとその同僚によって拡張された。[2] 2019年にブロード研究所でフェイ・チェンとエヴァン・マコスコの研究室は、ビーズ上のバーコードオリゴを使用するSlide-seqを開発した。[46]
参照
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