蛍光in situシーケンシング

蛍光 in situ シーケンシング( FISSEQ ) は、次世代シーケンシングを使用して、組織または培養物内に残っている細胞の RNA をシーケンシングする方法です。

FISSEQは、RNA- FISHの空間的コンテキストとRNA-seq のグローバルトランスクリプトームプロファイリングを組み合わせたものです。^[1] FISSEQは組織を保存し、単一分子のin situ RNA局在を可能にします。この方法の基礎は、生物学的サンプル内でcDNA アンプリコンを安定的に架橋する新しい核酸シーケンシングライブラリ構築方法です。 ^[2]次に、集中的なインターリーブ顕微鏡検査と生化学プロトコル、それに続く画像処理とバイオインフォマティクスによって、シーケンシングデータが生成されます。FISSEQは、細胞培養、組織切片、全載胚など、さまざまなサンプルタイプと互換性があります。FISSEQは、in situ核酸読み取りの非常に高密度な形式の一例です。RNA鎖に沿ったすべての文字が読み取られます。したがって、FISSEQのバーコードは、マウスの脳の場合は15〜20ヌクレオチド、標的癌遺伝子パネルの場合は5ヌクレオチドの短いDNA文字列に詰め込むことができます。

FISSEQ では、DNA ライゲーションや単一塩基 DNA ポリメラーゼ伸長などの一連の生化学的処理ステップが、固定された組織のブロック上で蛍光イメージングステップと交互に実行されます。このプロセスは、固定された組織で実行される点を除けば、市販のバルク DNA シーケンシング マシンでの合成による蛍光シーケンシングのメカニズムと概念的には同じです。サンプル内の各 DNA または RNA 分子は、最初にローリング サークル増幅によってその場で「増幅」 (つまり、コピー) され、親分子の同一コピーで構成される局所的な「ローリング サークル コロニー」(ロロニー) が作成されます。次に、一連の生化学的ステップが実行されます。k 番目のサイクルでは、蛍光タグが導入されます。このタグの色は、ロロニーの親 DNA 鎖に沿った k 番目の塩基の ID に対応します。次に、この状態でシステムを「一時停止」してイメージングを行います。各サイクルでサンプル全体をイメージングできます。次に、蛍光タグが切断されて洗い流され、次のサイクルが開始されます。組織内の単一の「親」DNAまたはRNA分子に対応する各ローロニーは、親分子のヌクレオチド配列に対応する一連の色を持つ局所的な「スポット」として、一連の蛍光画像に表示されます。各DNAまたはRNA分子のヌクレオチド配列は、蛍光顕微鏡によってその場で読み取られます。

FISSEQの開発は10年以上前に始まりました。^[1]基本原理は、シーケンシング革命の先駆けとなった原理に似ています。^{[3] [4] [5]}バルクハイスループットシーケンシングとFISSEQの両方で、短い配列が局所的に増幅され、1ヌクレオチドずつ画像化されます。しかし、従来のバルクシーケンシングのように単離され精製されたDNAではなく、無傷の組織内のRNAをシーケンシングする必要があるため、さらなる課題がありました。これらの制限は克服され、^[2] FISSEQは配列と空間情報を組み合わせたハイスループットの読み取りを可能にしました。

• ヌクレオシド三リン酸
• ポロニー配列