cDNA末端の急速な増幅

cDNA末端の迅速増幅（RACE ）は、細胞内にあるRNA転写産物の全長配列を得るために分子生物学で使用される技術です。RACEでは、逆転写によって目的のRNA配列のcDNAコピーが生成され、続いてcDNAコピーのPCR増幅が行われます（ RT-PCRを参照）。増幅されたcDNAコピーは配列決定され、十分な長さであれば固有のゲノム領域にマッピングされるはずです。RACEの後は通常、元々個々のRNA分子であったものを配列決定する前にクローニングが行われます。新しい転写産物構造の識別に有用な、よりハイスループットな代替手段は、次世代シーケンシング技術によってRACE産物を配列決定することです。

RACE は、転写産物内の小さな既知の配列から RNA の5' 末端(5' RACE-PCR) または3' 末端(3' RACE-PCR)までの RNA 転写産物の配列を提供できます。この技術は、片側 PCRまたはアンカー PCRと呼ばれることもあります。

RACE の最初のステップは、逆転写を使用してRNA 転写産物の領域のcDNAコピーを作成することです。このプロセスでは、転写産物の中央の既知の配列を使用して、転写産物の未知の末端部分がコピーされます。コピーされた領域は、5' 末端または 3' 末端のいずれかで既知の配列によって区切られます。

5' または 3' RACES のプロトコルは若干異なります。5' RACE-PCR は、まず mRNA をテンプレートとして、目的の遺伝子の中央にある既知の配列を認識するアンチセンス(逆)オリゴヌクレオチドプライマーを使用した最初の cDNA 合成 (または逆転写) 反応を実行します。このプライマーは遺伝子特異的プライマー(GSP)と呼ばれます。プライマーは mRNA に結合し、逆転写酵素がプライマーの 3' 末端に塩基対を追加して、特定の一本鎖 cDNA 産物を生成します。これが mRNA の逆相補鎖です。cDNA 合成後、末端デオキシヌクレオチド転移酵素(TdT) を使用して、ホモポリマー テールと呼ばれる同一のヌクレオチドの文字列を cDNA の 3' 末端に追加します。 (de novo cDNA 合成の最初の鎖に 3' 末端配列を追加する方法は他にもあり、ホモポリマー テーリングよりはるかに効率的ですが、方法の意味は同じです)。 次にPCRが実行され、既知の配列に結合する 2 番目のアンチセンス遺伝子特異的プライマー (GSP2) と、cDNA の 3' 末端に追加されたホモポリマー テールに結合するセンス (フォワード) ユニバーサル プライマー (UP) を使用して、5' 末端から cDNA 産物を増幅します。

3' RACE-PCR は、逆転写中のプライミングにすべての真核生物 mRNA の 3' 末端に存在する天然のポリ A テールを使用するため、この方法では TdT によるヌクレオチドの追加は必要ありません。ポリ A ストレッチを補完し、各 cDNA の 5' 末端に特別なアダプター配列を追加するオリゴ dT アダプター プライマー (デオキシチミン ヌクレオチドの短い配列を持つプライマー) を使用して cDNA が生成されます。次に、センス GSP とアダプター配列に補完的なアンチセンス プライマーを使用して、PCR を使用して既知の領域から 3' cDNA を増幅します。

RACE によって生成されたcDNA分子は、ハイスループット シーケンシング技術 (RACE-seq とも呼ばれる)を使用して配列決定できます。RACE フラグメントのハイスループット シーケンシング特性評価は、分子クローニングとそれに続く少数のクローンの サンガー シーケンシングによる従来のRACE フラグメント特性評価と比較して、時間効率が非常に高く、感度が高く、コストが低く、技術的に実現可能です。

RACE は、RNA 配列の一部が既知で、遺伝子特異的プライマーによってターゲットされている RNA 分子の未知の 5' (5'-RACE) または 3' (3'-RACE) 部分を増幅するために使用できます。これらの増幅された RACE 産物の特性評価のためのハイスループット シーケンシングと組み合わせることで、このアプローチを適用して、あらゆる種類のコーディングまたは非コーディング RNA 分子の特性評価を行うことができます。

RACEとハイスループットシーケンシングを組み合わせるというアイデアは、2009年にDeep-RACEとして初めて導入され、単一細胞株の17遺伝子の転写開始部位（TSS）のマッピングを実行しました。 ^[1]たとえば、合成siRNAによって誘導された標的RNAの切断部位を正確にマッピングする2014年の研究では、このアプローチは最初にRACE-seqと名付けられました。^{[2]さらに、この方法論は、}大腸がんにおける新規転写産物と融合転写産物の全長の未知の部分の特徴付けに使用されました。^[3] lncRNA の未知の転写産物構造の特徴付けを目的とした別の研究では、RACEがセミロング454シーケンシングと組み合わせて使用​​されました。^[4]

• 「5' cDNA 末端の急速増幅」『分子クローニング: 実験マニュアル』（Sambrook, J. および Russell, DW 編）第 8 章プロトコル 9、8.54-8.60（Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、ニューヨーク、米国、2001 年）
• 遺伝子操作とゲノミクスの原理、SB Primrose と RM Twyman、Blackwell Publishing、2006 年 (第 7 版)、111 ～ 112 ページ。

• RACE-seqに関するブログ記事