核酸検査

核酸検査（NAT ）は、特定の核酸配列を検出するために使用される技術であり、通常は特定の生物種または亜種、多くの場合は血液、組織、尿などで病原体として作用するウイルスまたは細菌を検出および識別するために使用されます。NATは、抗原や抗体ではなく遺伝物質（RNAまたはDNA ）を検出するという点で他の検査とは異なります。遺伝物質の検出により、抗原や抗体が血流中に現れ始めるまでに時間がかかるため、病気の早期診断が可能になります。^[1]特定の遺伝物質の量は通常非常に少ないため、多くのNATには遺伝物質を増幅する、つまり多くのコピーを作成するステップが含まれています。このようなNATは核酸増幅検査（NAAT ）と呼ばれます。増幅には、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、鎖置換アッセイ（SDA）、転写介在アッセイ（TMA）^[2]、ループ介在等温増幅（LAMP）など、いくつかの方法があります。^[3]

事実上すべての核酸増幅法および検出技術は、ワトソン-クリック塩基対合の特異性を利用しています。つまり、一本鎖のプローブまたはプライマー分子が相補鎖のDNAまたはRNA標的分子を捕捉します。したがって、プローブ鎖の設計は、検出の感度と特異性を高めるために非常に重要です。しかし、さまざまなヒト疾患の遺伝的基礎を形成する変異体は、通常、正常な核酸とはわずかに異なります。多くの場合、それらは挿入、欠失、および一塩基多型(SNP) など、単一の塩基が異なるだけです。この場合、不完全なプローブ-標的結合が簡単に発生し、常在菌株を病原菌株と間違えるなどの偽陽性の結果が生じる可能性があります。一塩基特異性の達成に多くの研究が費やされてきました。

対応する配列を持つ核酸(DNA および RNA) 鎖は、対になって鎖状にくっつき、衣類乾燥機で回転するマジックテープのように閉じます。しかし、鎖の各ノードはそれほど粘着性が高くないため、二重鎖は周囲の振動 (熱雑音またはブラウン運動と呼ばれる) の影響を受けて、絶えず部分的に解かれ、再び閉じます。対が長いほど安定します。核酸検査では、長い鎖に短い鎖がくっついた「プローブ」を使用します。長いプライマー鎖には、検出される病原体の「ターゲット」鎖に対応する (相補的な) 配列があります。病原体鎖は、長いプライマー鎖の露出部分 (「足掛かり」と呼ばれる) にしっかりとくっつき、その後、少しずつ短い「保護」鎖をプローブから外します。最終的に、短い保護鎖はどこにも結合せず、結合していない短いプライマーが検出可能になります。このセクションの残りの部分では、このプロセスを有用なテストに微調整するために必要な研究の歴史について説明します。

2012年に、Yinの研究グループは核酸ハイブリダイゼーションの特異性の最適化に関する論文を発表しました。^[4]彼らは、プレハイブリダイズされた相補鎖Cと保護鎖Pで構成される「トーホールド交換プローブ（PC）」を導入しました。相補鎖は保護鎖より長く、端に未結合のテール、つまりトーホールドを持っています。相補鎖はターゲット配列と完全に相補的です。正しいターゲット（X）がトーホールド交換プローブ（PC）と反応すると、Pが解放され、ハイブリダイズされた生成物XCが形成されます。反応の標準自由エネルギー（∆）はゼロに近くなります。一方、トーホールド交換プローブ（PC）が誤ったターゲット（S）と反応すると、反応は前進しますが、標準自由エネルギーが増加し、熱力学的に不利になります。標準自由エネルギーの差（∆∆）は、収量に明らかな差別を与えるのに十分重要です。識別係数 Q は、正しいターゲットのハイブリダイゼーションの収量を偽のターゲットのハイブリダイゼーションの収量で割って計算されます。5 つの正しいターゲットと、エネルギー的に代表的な 1 塩基の変化 (置換、削除、挿入) を持つ 55 の偽のターゲットを使用したさまざまなトーホールド交換プローブの実験を通じて、Yin のグループは、これらのプローブの識別係数は 3 から 100+ の間であり、中央値は 26 であると結論付けました。プローブは、10 °C から 37 °C、1 mM から 47 mM、および 1 nM から 5 M の核酸濃度で堅牢に機能します。また、トーホールド交換プローブは RNA 検出でも堅牢に機能することを解明しました。

その後も研究が進められ、2013年にはSeeligらの研究グループが、同じくトーホールド交換反応を利用した蛍光分子プローブに関する論文を発表した。^[5] これにより、正しいターゲットとSNPターゲットの光学的検出が可能になり、大腸菌由来のサンプル中のSNPの検出にも成功した。

2015年、デイビッドのグループは「競合的構成」と呼ばれるシステムを導入することで、一塩基変異体（SNV）の極めて高い（1,000以上）選択性を達成しました。^[6] このシステムでは、基礎となるハイブリダイゼーションプロセスの速度論的反応モデルを構築し、SNVと野生型（WT）の配列、プローブとシンクの設計アーキテクチャ、試薬濃度とアッセイ条件に基づいて変化する最適なパラメータ値を予測しました。彼らのモデルは、44の癌関連DNA SNVに対して中央値890倍、最小値200倍の選択性を達成しました。これは、以前のハイブリダイゼーションベースのアッセイに比べて少なくとも30倍の改善を表しています。さらに、彼らはこの技術をPCR後のヒトゲノムDNAからの低VAF配列のアッセイ、および合成RNA配列への直接アッセイに適用しました。

この専門知識に基づき、彼らはブロッカー置換増幅（BDA）と呼ばれる新しいPCR法を開発しました。^[7]これは温度に強いPCRで、約20 ntウィンドウ内のすべての配列変異体を野生型配列の1000倍に選択的に増幅し、元々0.1%以下の対立遺伝子頻度であった数百の潜在的な変異体を容易に検出および定量化できます。BDAは、56 °Cから64 °Cの範囲のアニール温度で同様の濃縮性能を実現します。この温度に強いことにより、ゲノム全体のさまざまな変異体の多重濃縮が容易になり、さらに希少DNA変異体の検出に安価で持ち運び可能なサーモサイクリング装置を使用できるようになります。BDAは、肺がん患者の血漿から採取された臨床細胞フリーDNAサンプルを含むサンプルタイプでも検証されています。

• 淋菌感染症およびその他のナイセリア感染症の診断：特定の淋菌DNAまたはRNA配列の増幅による検出。^[8]
• 泌尿生殖器クラミジア・トラコマティス感染症の診断^[9]
• 結核菌の検出^[10]
• HIV RNAまたはDNAの検出^[11]
• 人獣共通コロナウイルスの検出^[12]
• SARS-CoV-2の診断検査^[13]
• 抗生物質治療後の抗生物質耐性菌の検出^[14]