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免疫金標識法または免疫金染色法（IGS ）は、電子顕微鏡で使用される染色法です。[ 2 ]この染色法は、可視光における間接免疫蛍光法に相当します。コロイド金粒子は、多くの場合、二次抗体に結合し、二次抗体は、特定の抗原または他の細胞成分に結合するように設計された一次抗体に結合します。金は、電子密度が高いため電子散乱が増加し、高コントラストの「暗いスポット」が得られるため使用されます。 [ 3 ]
1971年に初めて用いられた免疫金標識法は、透過型電子顕微鏡、走査型電子顕微鏡、および明視野顕微鏡のいずれにも応用されている。この標識技術は、異なるサイズの金粒子を用いることで、複数の対象物を識別するように応用できる。
免疫金標識法では、金粒子が標識対象物からある程度離れた場所に存在するため、アーティファクトが生じる可能性があり、サンプル調製時に非常に薄い切片を作成する必要がある。[ 3 ]
免疫金標識は、1971 年に Faulk と Taylor によってサルモネラ抗原の同定に初めて使用されました。[ 2 ] [ 4 ]当初は透過型電子顕微鏡 (TEM) に適用され、特定の細胞表面抗原など、低密度で存在するタンパク質を強調するのに特に役立ちました。 [ 5 ] 走査型電子顕微鏡 (SEM) の解像度が向上するにつれて、免疫金などのナノ粒子サイズの標識の必要性も高まりました。1975 年に Horisberger らは直径 30 nm未満の金ナノ粒子の可視化に成功し[ 6 ] 、これはすぐに確立された SEM 技術となりました。[ 5 ]
まず、試料の薄い切片が、多くの場合ミクロトームを使用して切断されます。[ 7 ]その後、試料調製の他のさまざまな段階が行われる場合があります。
調製したサンプルを、目的の分子に結合するように設計された特異抗体とインキュベートする。[ 3 ]次に、金粒子が付着した二次抗体を添加し、一次抗体と結合させる。金は、二次抗体の代わりにプロテインAまたはプロテインGに付着させることもできる。これらのタンパク質は、哺乳類のIgG Fc領域に非特異的に結合するためである。[ 6 ]
電子密度の高い金粒子は、電子顕微鏡下では黒い点として観察され、間接的に目的の分子を標識することができる。[ 3 ]
免疫金標識法は、複数の標的を同時に可視化するために使用できます。電子顕微鏡では、これはサイズの異なる2つの金粒子を使用することで実現できます。[ 8 ]この方法を拡張して、3つの異なるサイズの金粒子を使用して、調節ペプチドの局在を追跡しています。[ 9 ]多部位標識のより複雑なアプローチでは、抗原部位の反対側を別々に標識します。両側に付着した免疫金粒子を同時に観察できます。[ 10 ]
免疫金標識は通常、透過型電子顕微鏡に使用されますが、金が「銀増強」されている場合は、明視野顕微鏡を使用して観察できます。[ 11 ]銀増強により粒子サイズが大きくなり、走査型電子顕微鏡も可能になります。
銀強化金粒子を生成するには、コロイド金を銀イオンを含む酸性強化溶液に入れる。金粒子は核生成サイトとして機能し、その上に銀が沈着する。銀強化免疫金標識法（IGSS）の一例として、病原体Erwinia amylovoraの同定への使用が挙げられる。[ 11 ]
免疫金標識法の本質的な限界は、金粒子が 一次抗体が結合する部位から約 15～30 nm 離れていることである[ 5 ] (一次抗体と二次抗体の標識戦略を使用する場合)。そのため、標的分子の正確な位置を正確に計算することはできない。金粒子は直径 1 nm (またはそれ以下) で作成できるが、その場合、別の限界が生じる。このサイズでは、金標識が組織構造と区別しにくくなる。[ 2 ] [ 5 ]
免疫金標識には薄切片が必要ですが、薄切片では誤解を招く画像が得られる可能性があります。細胞構成要素の薄切片では、その三次元構造を正確に把握できない場合があります。例えば、微小管は、切断面によっては「スパイク」のように見えることがあります。この制限を克服するために、連続切片を作成し、それらを組み合わせて三次元画像を作成することができます。[ 3 ]
もう一つの制約は、抗体や金粒子がイメージング用のサンプルを包埋するために使用される樹脂を透過できないことです。そのため、アクセス可能な分子のみを標的として可視化できます。サンプルを包埋する前に標識することで、この制約による悪影響を軽減できます。[ 3 ]