ファイバー測光

ファイバー測光法は、神経回路を研究するために、脳領域または機能ネットワーク内の特定の細胞タイプから「バルク」または集団レベルのカルシウム（Ca ²⁺）活性^{[1]を捕捉する}カルシウムイメージング技術である^{[2] [3] [4] [5] [6]}集団レベルのカルシウム活性は、空間学習、記憶想起、目標指向行動などの行動課題と相関させることができます。^[7]この技術では、生きた動物の脳に光ファイバーを外科的に埋め込みます。研究者にとっての利点は、光ファイバーは他のカルシウム法よりも埋め込みが簡単で、侵襲性が低く、安価であり、ミニスコープに比べて動物への重量とストレスが少ないことです。また、相互作用する複数の脳領域をイメージングし、他の神経科学技術と統合することもできます。ファイバー測光の制限は、細胞および空間解像度が低いことと、動物を硬いファイバー束にしっかりと固定する必要があるため、マウスなどの小型哺乳類の自然な行動に影響を及ぼす可能性があることです。

ファイバー測光法は、 GCaMPやRCaMPなどの遺伝子コード化カルシウム指示薬（GECI）の発現に依存しており、これらは、それぞれ興奮性ニューロンおよび汎ニューロン発現を付与するCa2+/カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼII（CaMKII）およびヒトシナプシン（hSyn）などの細胞特異的プロモーターを使用して特定の細胞に標的化できます。 ^{[1]これらのプロモーターは、}グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）プロモーターを使用して、アストロサイトなどのカルシウム動態を示す非ニューロン細胞だけでなく、さまざまなニューロンサブタイプを標的とするために使用できます。 ^{[8] [9] [10] [11]ニューロンとアストロサイトの両方で、活動電位、神経伝達物質の}エキソサイトーシス、シナプス可塑性の変化、遺伝子転写の形での細胞活動は、Ca ²⁺イオンの流入と連動しています。 ^[5]

細胞内カルシウム濃度のこれらの活動依存的な変化は、GECIを細胞に導入することで監視できます。このイオンの流入に続いて、GECIはCa ^{2+結合時に蛍光を発し、}蛍光の変化は細胞内カルシウムの変化に比例します。^[12]ファイバー測光法（およびその他の生体内イメージング法）で最も一般的に使用されるカルシウム指示薬はGCaMP6ですが、独自の蛍光スペクトル、動態、信号対雑音比、カルシウム感受性を備えた追加のGECIが開発され続けています。^{[13] [14]これらの指標は、主に}ウイルス発現^[15]とトランスジェニックマウスラインの2つの方法で脳内で発現できます。^{[16]最近、}ドーパミンシグナル伝達を記録するdLightやオレキシンを記録するOxLightなど、さまざまな化学シグナルを測定するために利用できるようになった指標のリストが増えています。^{[15] [17] [18] GCaMP、RCaMP、dLightなどの指標は、最適な}波長の光源によって励起され、それに応じて独自の光を放射し、時間の経過に伴うカルシウムや神経伝達物質の動態を記録することができます。^{[15] [19] [13] [3] [20] [21]}

ファイバー測光システムは、カルシウム（GCaMPなど）または神経伝達物質指標（dLightなど）に固有の光の正確な励起波長を届けるように設計されています。^[3]この光は光ファイバーを通って、脳領域または関心領域に埋め込まれた光ファイバーまで伝わります。細胞タイプに特異的な方法で発現するカルシウム指標は、この光によって励起され、次に同じ光ファイバーを通って戻る独自の信号を発します。^{[3] [4] [22]}これらの収集された発光信号は、ダイクロイックミラーによってスペクトル的に分離され、フィルターを通過して光検出器、科学カメラ、またはPMTに焦点を合わせます。^[3]収集された信号は、初期ベースライン（F）に対する蛍光の変化（ΔF）を表します。次に、研究者はカルシウムトランジェント（ΔF/F）に対応する信号を観察できます。この時系列データは、pMAT、^[23] pyPhotometry ^{[24]およびGuPPy [25]}などのさまざまなオープンソースパイプラインを使用して分析できます。

重要なのは、等吸収シグナルはカルシウム非依存性シグナル（約 405～415 nm）であり、カルシウム依存性波長（GCaMP の場合は 470 nm）とは対照的であるということです。GCaMP には Ca ^{2+結合と非結合の 2 つの状態があるため、2 つのタンパク質構造はそれぞれ独自の励起および発光スペクトルを持ちます。GCaMP が Ca 2+ の}有無にかかわらず同じ吸光度を示す励起波長が等吸収であり、カルシウム非依存性蛍光ベースラインを決定します。動物の動きと組織の自己蛍光は、このカルシウム非依存性シグナルに反映され、減算または回帰することで蛍光の真の変化を明らかにすることができます。^[26]

遺伝的にコード化されたカルシウム指示薬（GECI）の最適な発現は、アデノ随伴ウイルスベクターとトランスジェニックげっ歯類の系統の2つの方法で達成できます。^{[15] [16]}ウイルス注入では、関心のある脳領域にGECIを注入する必要があります。^{[15]このウイルスは、興奮性ニューロンとアストロサイトをそれぞれ標的とする}CaMKIIやGFAPなどの細胞特異的プロモーターを使用することで、特定の細胞タイプに感染するように標的化できます。これにより、埋め込まれた光ファイバーを介して、遺伝的に定義されたニューロンまたはグリア細胞のサブポピュレーションから神経活動を記録できます。^[1]ウイルス発現では、脳内で最適な発現を得るために希釈倍数の滴定が必要であり、特定の実験ではトランスジェニックげっ歯類の系統を使用する代わりに、希釈​​倍数を決定する必要があります。 GECIの発現は、脳全体で普遍的な発現を可能にするトランスジェニック系統を使用することで達成することもできます。マウスまたはラットの系統によっては、脳の領域間で発現が異なる場合があり、記録中に潜在的な課題が生じる可能性があります。^[16]

GCaMP は、複数のイメージング法で一般的に使用されている遺伝子コード化カルシウム指示薬 (GECI) です。^[19] GCaMP は、指示薬がカルシウムイオン (Ca ²⁺ ) に結合すると蛍光を発します。このカルシウム信号は、神経応答パターン、神経伝達物質の放出、膜興奮性に直接結びついています。^{[27] GCaMP とその等吸収信号の励起波長は、それぞれ約 470 nm と 415 nm (青) です。目標は、指示薬の最大吸収点と}等吸収点を光励起することです。GCaMP の等吸収点は、カルシウム非依存信号で、約 405～415 nm です。これは、GCaMP がカルシウムイオンに結合している状態と結合していない状態の 2 つの機能状態を持つことに基づいて決定されます。これら 2 つの状態には、固有のタンパク質励起スペクトルと発光スペクトルがあります。これら 2 つのタンパク質状態が同じ吸光度を持つ励起波長が等吸収点であり、ベースライン蛍光を決定します。このカルシウム非依存性信号には動きと自己蛍光が反映されており、これを減算または回帰することで、行動課題または実験操作中の細胞蛍光の真の変化を明らかにすることができる。^[26]

GCaMP の発光波長は約 525 nm (緑) であり、行動課題中に時間経過にわたって分析および相関させることができます。

複数の細胞タイプにおける同時カルシウム動態を観察するために、研究者らは単一の脳領域に 2 つ以上の GECI を組み合わせてきました。^{[3] [28]}たとえば、ある研究グループは、自由に行動するマウスの線条体直接経路および間接経路の有棘投射ニューロンで異なって発現した緑と赤の GECI、GCaMP6f と jRGECO1a からの蛍光を記録しました。 ^[29]同じ脳領域での複数の GECI の発現は、以前の研究で示されているように、2 セットのニューロンで実行できるだけではありません。これらのバルクカルシウムの同時記録は、ニューロンやアストロサイトなど、複数の細胞タイプでも実行できます。これらの細胞タイプは、GFAP や hSyn などの独自のプロモーターを発現し、このようにして GECI を特異的に標的とすることができます。別の研究グループは、マウスが自由にワーキングメモリタスク (T 迷路) を実行している間に、アストロサイトおよびニューロンに特異的なプロモーターを使用して、2 色ファイバー測光法を成功させました。^[30]

ファイバー測光の目的は、関心のある脳領域内の特定の細胞集団から大量のカルシウム信号を正確に伝達、抽出、記録することです。信号にアクセスするには、GECI発現部位に光学カニューレ/ファイバーを外科的に埋め込む必要があります。この光ファイバーは、個々の細胞活動ではなく、集団レベルのカルシウム信号のみを収集できます。^[1]さらに、光ファイバーは深部と浅部の両方の脳構造からの記録を可能にし、GRINレンズや皮質ウィンドウとは異なり、組織の損傷を最小限に抑えます。

GCaMPは、それぞれ約470 nmと530 nmに特定の励起スペクトルと発光スペクトルを持っています。^[27] LED光源は、GECIを励起するために必要な光パワーが低いため、最も一般的に選択されています。脳からイメージングデバイスへの励起信号と発光信号の双方向の適切な伝送は、ダイクロイックミラーと励起/発光フィルターによって調整されます。イメージングデバイスには、光検出器、光電子増倍管（PMT）、科学カメラの3種類があります。単一の脳領域から信号を収集する場合、取得が速く信号対雑音比（SNR）が低いため、光検出器またはPMTを使用するのが一般的です。または、複数の脳領域から収集する場合は、科学カメラまたは複数の光検出器またはPMTを使用する必要があります。

全体として、このシステムは、光カニューレ、光源、およびイメージング デバイス間の結合を可能にします。GECI への正確な光伝送は光カニューレ/ファイバーによって可能になり、記録中に放出信号はイメージング デバイスによって収集されます。

市販されているファイバー測光システムの例としては、Neurophotometrics、Inscopix、MightexBio などがあります。

すべての科学的手法には、使用前に考慮しなければならない事項があります。ファイバー測光法は、カルシウムイメージングの他の手法に比べて多くの利点がありますが、制限もあります。

カルシウムイメージングを実験に取り入れたいが、まだ経済的または技術的な事情で導入できない研究室の人たちにとって、ファイバー測光法は参入障壁が低い。光ファイバーは、1光子または2光子イメージングなどの他のカルシウム法よりも埋め込みが簡単で、侵襲性が低く、安価である。^{[14]ミニスコープに比べて動物への重量とストレスが少ないため、縦断的[31]}行動パラダイムに適している。他の方法に比べて動物の可動性が大幅に制限されないため、大型のげっ歯類モデルでより自由に動く自然な行動が可能になる。この技術は多用途で、複数の相互作用する脳領域をイメージングし、オプトジェネティクス^[32]、電気生理学^[33]、およびよりシステムレベルの神経科学技術と統合することができる。最近では、この技術を神経伝達物質の活性またはpH変化の他の蛍光指標と組み合わせることができる。^{[15] [21]}

実験を計画する際には、ファイバー測光法の主な限界である細胞および空間分解能の低さを考慮することが重要です。この光学分解能の欠如は、視野内の活動の集合体の収集に起因し、蛍光信号の「バルク」変化のみを許容します。^[5]光学カニューレのサイズは、1光子顕微鏡や2光子顕微鏡などの他のカルシウムイメージング法で使用される技術よりもはるかに小さいですが、動物は硬いファイバー束にしっかりと固定する必要があります。^[1]これにより、マウスなどの小型哺乳類の自然な行動が制限される可能性があります。

ファイバー光測定法を細胞操作と統合することで、神経活動と行動の因果関係を明らかにすることができます。脳内の特定の細胞タイプと投射を標的とした変調は、オプトジェネティクスまたはデザイナードラッグによってのみ活性化されるデザイナー受容体（DREADD）を使用して実現できます。^[14]この方法は、実験設計に必要な時間精度などに基づいて選択されます。オプトジェネティクスでは、特定の細胞タイプを高い時間精度で操作できます。DREADDは、クロザピン-N-オキシド（CNO）^[34]やデスクロロクロザピン（DCZ）などのリガンドの薬物動態により、時間精度がはるかに低くなります。^[35]同時に光読み出しとオプトジェネティクス操作を行うと、以下で説明するいくつかの潜在的な問題が発生することに注意することが重要です。^[32]

さらに、ファイバー測光法は、同じ動物内での生体内 電気生理学と組み合わせることもできる。 ^[33]電気生理学的記録とカルシウムイメージングを組み合わせることで、自由に行動する動物モデルにおける神経活動電位のより高い時間精度での読み出しにより、細胞タイプ特有の活動を観察することができる。

オプトジェネティックプローブとカルシウム指示薬を同じニューロンに送達して発現させると、問題が生じる可能性があります。カルシウム指示薬と操作チャネルは、GCaMPやチャネルロドプシン (ChR2)など、励起スペクトルが重複することがあります。これらは両方とも約 470 nm で励起のピーク波長を持ちます。カルシウム指示薬の励起は、オプトジェネティック光感受性イオンチャネルを活性化する可能性があります。測定されたカルシウム信号の変化は、カルシウムの実際の変化やオプトジェネティック誘導信号に簡単には結び付けられません。この問題の解決策には、オプトジェネティックプローブまたはカルシウム指示薬と励起スペクトルが重複しない指示薬を組み合わせることが含まれます。カルシウム指示薬 (GCaMP、RCaMP) と励起 (ChR2、Crimson) および抑制 ( eNpHR、Arch、Jaws) 用のオプトジェネティックプローブが、このためのオプションです。

ミニスコープ^{[36] [37] [38] [39]}は、自由に行動しているマウスやラットの大規模な神経活動集団を画像化できる、頭部に装着する小型顕微鏡です。これは、マウスやラットが簡単に持ち運べるほど軽量で、行動に大きな支障をきたさないため可能です。研究者は、ミニスコープを、脳深部および表層の画像化を可能にする埋め込み型屈折率勾配（GRIN）レンズまたは皮質ウィンドウと組み合わせます。 ^{[38] [5] [40]}この方法は、1匹の動物内の遺伝的および空間的に定義された数百の細胞の活動をモニタリングするのに最適です。^[37]ファイバー測光法と比較して、ミニスコープは高い細胞解像度での画像化を可能にし、個々のニューロンおよび非ニューロン細胞内のカルシウムの変化を検出します。^[36]さらに、この方法では、時間の経過に伴う繰り返しの画像化が可能になり、「健康」状態から病理学的状態への移行や行動の過程での変化を分析できます。^[37]しかし、このイメージング法は感度が低くノイズが多く、2光子などの他の多光子法と比較して解像度の低いイメージングになります。^[7]これらの小型顕微鏡は、上で説明したように、ここでの光遺伝学とカルシウムイメージングの組み合わせに必要な遠赤方偏移指標を検出する能力に限界があります。

2光子イメージング^{[41] [5]}は、細胞のGECIダイナミクスの変動を記録する別のカルシウムイメージング法です。これは、脳の表面から600〜700ミクロン下まで、光散乱性の高い脳組織を透過する方法を提供します。^{[36] [42]}他の技術と比較して、2光子は、明確に定義された焦点面内で、樹状突起や軸索のボタン内など、細胞および細胞内の空間分解能が高くなります。^{[36] [41]}ただし、光学カニューレやマイクロ内視鏡の助けがなければ、この方法はより表面的な脳領域に限定されます。^{[36] [43] [44]}このタイプのイメージングでは、動物の頭部を固定したままにしておく必要があり、複雑な行動タスクに必要な自然な行動が制限されます。^{[41] [36]}