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等電点電気泳動（IEF ）は、電気フォーカシングとも呼ばれ、等電点（pI）の違いによって異なる分子を分離する技術です。 [1] [2]これは、通常ゲル内のタンパク質に対して行われるゾーン電気泳動の一種であり、対象分子の全体的な電荷が周囲のpHの関数であるという事実を利用しています。 [3]
手順
IEF では、両性電解質溶液を固定化 pH 勾配(IPG) ゲルに加えます。IPG は、pH 勾配と共重合したアクリルアミドゲル マトリックスで、最もアルカリ性の pH 値 (>12) を除いて、完全に安定した勾配が得られます。固定化 pH 勾配は、固定化物質の比率を連続的に変化させることで得られます。固定化物質は、pK 値によって定義される弱酸または弱塩基です。
等電点(pI)より低い pH 領域にあるタンパク質は正に帯電し、陰極 (負に帯電した電極) に向かって移動します。しかし、pH の勾配が増加するにつれて、タンパク質の全体的な電荷は、タンパク質がその pI に対応する pH 領域に達するまで減少します。この時点では正味の電荷がなくなり、移動は停止します (どちらの電極に対しても電気的な引力はないため)。その結果、タンパク質はシャープな固定バンドに焦点が絞られ、各タンパク質は pH 勾配内の pI に対応するポイントに配置されます。この技術は、非常に高い解像度が可能で、1 つの電荷が異なるタンパク質を別々のバンドに分画します。
焦点を合わせる分子は、pH 勾配 (通常は脂肪族両性 電解質によって生成される) を持つ媒体上に分散されます。電流が媒体に流され、「正」の陽極と「負」の陰極端が生成されます。負に帯電した分子は媒体の pH 勾配を通って「正」端に向かって移動し、正に帯電した分子は「負」端に向かって移動します。粒子は電荷の反対極に向かって移動すると、変化する pH 勾配を通って移動し、その分子の等電点の pH に達するまで移動します。この時点で、分子は正味の電荷を持たなくなり (関連する官能基のプロトン化または脱プロトン化による)、ゲル内でそれ以上進むことはありません。勾配は、まずさまざまな pI 値を持つ ポリ両性電解質などの小分子の溶液を電気泳動にかけることで、対象の粒子を追加する前に確立されます。
この方法は、酸性残基と塩基性残基の相対含有量に基づいて分離するタンパク質の研究に特によく適用され、その値は pI で表されます。タンパク質は、 pH 勾配が確立されているポリアクリルアミド、デンプン、またはアガロースで構成された固定化 pH 勾配ゲルに導入されます。このプロセスでは、通常、大きな細孔を持つゲルが使用され、「ふるい分け」効果、つまり異なるサイズのタンパク質の移動速度の違いによって生じる pI のアーティファクトを排除します。等電点電気泳動は、pI値が 0.01 しか異なるタンパク質を分離できます。[4]等電点電気泳動は、 2 次元ゲル電気泳動の最初のステップであり、タンパク質は最初に pI 値によって分離され、次にSDS-PAGEによって分子量によってさらに分離されます。一方、等電点電気泳動は、一定の pH での分取ネイティブ PAGEの唯一のステップです。[5]
生きた細胞
いくつかの意見によると、[6] [7]生きた真核細胞は、その内部でタンパク質の等電点電気泳動を行い、酵素とその反応物の拡散による代謝反応速度の制限を克服し、特定の生化学プロセスの速度を調節します。特定の代謝経路の酵素を細胞内部の明確で小さな領域に集中させることで、細胞は特定の生化学経路の速度を数桁増加させることができます。例えば、リン酸化または脱リン酸化によって酵素分子の等電点 (pI) を変更することで、細胞は酵素分子を細胞内部の異なる部分間で移動させ、特定の生化学プロセスのスイッチをオンまたはオフにすることができます。
マイクロ流体チップベース
マイクロチップベースの電気泳動は、迅速なタンパク質分析、他のマイクロ流体ユニット操作との簡単な統合、チャネル全体の検出、ニトロセルロースフィルム、より小さなサンプルサイズ、およびより低い製造コストを提供できる可能性があるため、キャピラリー電気泳動の有望な代替手段です。
マルチジャンクション
より高速で使いやすいタンパク質分離ツールの需要が高まったことにより、IEF の溶液中分離への進化が加速しました。これに関連して、高速でゲルフリーの IEF 分離を実行するために、マルチジャンクション IEF システムが開発されました。マルチジャンクション IEF システムは、一連の容器を使用し、各容器にキャピラリーが通過します。[8]各容器のキャピラリーの一部は半透膜に置き換えられています。容器には異なる pH 値の緩衝液が含まれているため、キャピラリー内に pH 勾配が効果的に確立されます。各容器の緩衝液は、高電圧電源に接続された電圧分割器と電気的に接触しており、これによりキャピラリーに沿って電界が確立されます。サンプル (ペプチドまたはタンパク質の混合物) がキャピラリーに注入されると、電界と pH 勾配の存在により、これらの分子が等電点に従って分離されます。マルチジャンクションIEFシステムは、2次元プロテオミクス[9]のためのトリプシンペプチド混合物の分離や、バイオマーカー発見のためのアルツハイマー病患者の血漿タンパク質の分離に使用されている。[8]
参考文献
- ^ ベングト、ビェルクヴィスト;えー、クリスティーナ。リゲッティ、ピエール・ジョルジョ。ジャンナッツァ、エリザベッタ。ゲルグ、アンジェリカ。ウェスターマイヤー、ライナー。ヴィルヘルム・ポステル (1982)。 「固定化pH勾配における等電点電気泳動：原理、方法論、およびいくつかの応用」。生化学および生物物理学的方法のジャーナル。6 (4): 317–339。土井：10.1016/0165-022X(82)90013-6。ISSN 0165-022X。PMID 7142660。
- ^ Pier Giorgio Righetti (2000 年 4 月 1 日)。等電点電気泳動: 理論、方法論、応用。Elsevier。ISBN 978-0-08-085880-7。
- ^ David Edward Garfin (1990). 「等電点電気泳動」. タンパク質精製ガイド. 酵素学の方法. 第182巻. pp. 459–77. doi :10.1016/0076-6879(90)82037-3. ISBN 9780121820831. PMID 2314254。
- ^ Stryer、Lubert: 「生化学」、50 ページ。Spektrum Akademischer Verlag、1996 (ドイツ語)
- ^ Kastenholz, B (2004). 「分取ネイティブ連続ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (PNC-PAGE): 生物系におけるカドミウム補因子の効率的な分離法」. Analytical Letters . 37 (4). Informa UK Limited: 657–665. doi :10.1081/al-120029742. ISSN 0003-2719. S2CID 97636537.
- ^ Flegr J (1990). 「細胞は等電点電気泳動を行うか？」(PDF) . BioSystems . 24 (2): 127–133. Bibcode :1990BiSys..24..127F. doi :10.1016/0303-2647(90)90005-L. PMID 2249006.
- ^ Baskin EF; Bukshpan S; Zilberstein GV (2006). 「pH誘導性細胞内タンパク質輸送」. Physical Biology . 3 (2): 101–106. Bibcode :2006PhBio...3..101B. doi :10.1088/1478-3975/3/2/002. PMID 16829696. S2CID 41599078.
- ^ ab Pirmoradian M.; Astorga-Wells, J.; Zubarev, RA. (2015). 「マルチジャンクションキャピラリー等電点電気泳動装置とオンライン膜支援バッファー交換装置の組み合わせにより、バイオマーカー発見のためのインタクトなヒト血漿タンパク質の等電点分画が可能に」(PDF) .分析化学. 87 (23): 11840–11846. doi :10.1021/acs.analchem.5b03344. hdl :10616/44920. PMID 26531800.
- ^ Pirmoradian, M.; Zhang, B.; Chingin, K.; Astorga-Wells, J.; Zubarev RA (2014). 「2次元ショットガンプロテオミクスのためのマイクロ分取分画装置としての膜支援等電点電気泳動装置」.分析化学. 86 (12): 5728–5732. doi :10.1021/ac404180e. PMID 24824042.