メチル化分析のためのベイズツール

メチル化解析のためのベイズツール（ BATMANとも呼ばれる）は、メチル化DNA免疫沈降（MeDIP）プロファイルを解析するための統計ツールです。オリゴヌクレオチドアレイ（MeDIPチップ）または次世代シーケンシング（MeDIP-seq）を使用して生成された大規模なデータセットに適用でき、関心領域における絶対的なメチル化状態の定量的な推定を提供します。 ^[1]

MeDIP (メチル化 DNA 免疫沈降) は、抗体を使用してメチル化 DNA 配列を分離することによりDNAのメチル化レベルを評価する実験技術です。分離された DNA 断片は、マイクロアレイ チップ (MeDIP-chip) にハイブリダイズされるか、次世代シーケンシング (MeDIP-seq) によって配列決定されます。これにより、ゲノムのどの領域がメチル化されているかがわかりますが、絶対的なメチル化レベルはわかりません。2 つの異なるゲノム領域AとBを想像してください。領域Aには 6 つの CpG (哺乳類の体細胞における DNA メチル化は、一般的に CpGジヌクレオチドで発生します^[2] ) があり、そのうち 3 つがメチル化されています。領域Bには 3 つの CpG があり、すべてがメチル化されています。抗体はメチル化 DNAを認識するだけなので、これらの領域の両方に等しく結合し、後続のステップでは、これら 2 つの領域に等しいシグナルが表示されます。これでは、これら 2 つの領域におけるメチル化の全体像は得られません (領域AではCpG の半分のみがメチル化されていますが、領域Bではすべての CpG がメチル化されています)。したがって、特定の領域のメチル化の全体像を得るには、MeDIP 実験から取得した信号をその領域内の CpG の数に正規化する必要があります。これは Batmanアルゴリズムが行うことです。上記の例の MeDIP 信号を分析すると、領域Aの Batman スコアは 0.5 (つまり、領域は 50% メチル化されています)、領域Bの Batman スコアは 1 (つまり、領域は 100% メチル化されています) になります。このようにして、Batman は MeDIP 実験からの信号を絶対メチル化レベルに変換します。

Batman アルゴリズムの核となる原理は、CpG ジヌクレオチドの密度の変化の影響と、それが DNA フラグメントの MeDIP 濃縮に与える影響をモデル化することです。Batman の基本的な仮定は次のとおりです。

1. 哺乳類における DNA メチル化はほぼすべてCpG ジヌクレオチドで起こります。
2. CpGの少ない領域のほとんどは恒常的にメチル化されているが、CpGの多い領域（CpGアイランド）のほとんどは恒常的にメチル化されていない。^[3]
3. MeDIP 実験では断片バイアスはありません (DNA 断片サイズのおおよその範囲は 400～700 bp です)。
4. マイクロアレイ上の誤差は精度をもって正規分布します。
5. メチル化された CpG のみが観測される信号に寄与します。
6. CpGのメチル化状態は、一般的に数百塩基にわたって高い相関関係にあるため^[4]、50bpまたは100bpのウィンドウでグループ化されたCpGは同じメチル化状態になります。

バットマンの基本パラメータ:

1. C _{cp : プローブ p と CpG ジヌクレオチド}c間の結合係数は、 CpG  c を含むプローブpにハイブリダイズするDNA分子の割合として定義されます。
2. C _tot  : 総CpG影響パラメータは、任意のプローブの結合係数の合計として定義され、局所CpG密度の尺度を提供します。
3. m _{c : 位置}c のメチル化状態。これは、サンプル内の染色体のうちメチル化されている部分の割合を表します。MeDIP研究で使用されるサンプルの大半には複数の細胞タイプが含まれているため、 m _cは連続変数と見なされます。

これらの仮定に基づくと、MeDIP-chip または MeDIP-seq 実験の MeDIP チャネルからの信号は、そのプローブと重なる DNA 断片の濃縮度に依存し、これは抗体の結合量に依存し、したがってそれらの断片上のメチル化された CpG の数に依存します。Batman モデルでは、MeDIP/chip 実験からの完全なデータセット A は、次の確率分布の形式で統計モデルによって表すことができます。

${\displaystyle f(A\mid m)=\prod _{p}\phi \left(A_{p}\mid A_{\text{base}}+r\sum _{c}C_{cp},\nu ^{-1}\right),}$

ここで、( x | μ ,  σ ^{2 ) は}ガウス確率密度関数です。標準的なベイズ法を使用して、1 つ以上の MeDIP-chip/MeDIP-seq 出力セットが与えられた場合に考えられるメチル化状態の分布であるf ( m | A ) を推測できます。この推測問題を解決するために、Batman はネストされたサンプリング(http://www.inference.phy.cam.ac.uk/bayesys/) を使用して、ゲノムの各タイル領域についてf ( m | A )から 100 個の独立したサンプルを生成し、次にこれらのサンプルにベータ分布を当てはめて 100 bp ウィンドウ内の最も考えられるメチル化状態を要約します。最も考えられるベータ分布のモードが最終的なメチル化判定として使用されました。 ${\displaystyle \phi}$

Batman の使用を検討する際には、次の点を考慮すると役立つ場合があります。

1. Batman はソフトウェアではなく、コマンド プロンプトを使用して実行されるアルゴリズムです。そのため、特にユーザーフレンドリーではなく、非常に計算技術的なプロセスです。
2. 非商用であるため、マニュアルに記載されている内容以外に Batman を使用する際のサポートはほとんどありません。
3. これはかなり時間がかかります (1 つの染色体を分析するのに数日かかることがあります)。 (注: ある政府研究所では、Agilent の Genomic Workbench ソフトウェアを使用して、100 個の Agilent Human DNA Methylation Array (アレイあたり約 250,000 個のプローブ) のセットで Batman を実行するのに 1 時間もかかりませんでした。私たちのコンピューターは、2GHz プロセッサ、24 GB RAM、64 ビット Windows 7 を搭載していました。)
4. コピー数変異(CNV) を考慮する必要があります。たとえば、がんにおける CNV 値が 1.6 (正常と比較して 0.4 の損失) の領域のスコアは、損失を補うために 1.25 (=2/1.6) を掛ける必要があります。
5. バットマンの基本的な仮定の一つは、すべてのDNAメチル化はCpGジヌクレオチドで起こるというものである。これは脊椎動物の体細胞では一般的に当てはまるが、植物細胞や胚性幹細胞などではCpG以外のメチル化が広範囲に及ぶ場合もある。^{[5] [6]}