アルデヒドタグ

アルデヒドタグは短いペプチドタグであり、これをさらに修飾して蛍光体、グリカン、PEG（ポリエチレングリコール）鎖、または反応性基を追加し、さらに合成することができます。^[1]コンセンサス配列LCxPxRを持つ短い遺伝的にコード化されたペプチドを融合タンパク質に導入し、その後のホルミルグリシン生成酵素（FGE）による処理により、タグのシステインが反応性アルデヒド基に変換されます。この求電子基は、アミノオキシまたはヒドラジド官能化化合物などのさまざまなアルデヒド特異的試薬の標的にすることができます。

アルデヒドタグは、ホルミルグリシン生成酵素（FGE）によって認識される人工ペプチドタグです。ホルミルグリシンは、 α炭素にホルミル基（-CHO）を持つグリシンです。^[2]スルファターゼモチーフは、システインをホルミルグリシン残基に部位特異的に変換するペプチド配列の基礎です。ペプチドタグは、さまざまな生物のスルファターゼのFGE認識配列の研究で、細菌、古細菌、真核生物のスルファターゼモチーフに高い相同性が明らかになった後に設計されました。^[3]

アルデヒドとケトンは求電子特性のため化学レポーターとして使用される。これらの特性により、強力な求核カップリングパートナーを使用すると、穏やかな条件下での反応が可能になる。通常、ヒドラジドとアミノオキシプローブは、生理的反応条件下で好ましいカルボニル基との安定化付加生成物を形成することにより、バイオコンジュゲーションに使用される。中性pHでは、シッフ塩基形成の平衡は反応物側に大きく偏っている。安定したヒドラゾンとオキシムを形成するために、化合物誘導体を使用してより多くの生成物を生成する。触媒の添加に伴う毒性のために、pH最適値4～6は達成できないため、生細胞での反応は遅い。典型的な反応定数は10 ⁻⁴～10 ⁻³ M ⁻¹ s ⁻¹である。^[4]

カルボニル基は、終止コドン抑制やアルデヒドタグ付けなどのさまざまな技術を使用して、化学レポーターとしてタンパク質に導入されます。 ^{[3] [5]}アルデヒドとケトンの使用を制限するのは、特定の細胞環境でのそれらの制限された生体直交性です。化学レポーターとしてのアルデヒドとケトンの制限は次のとおりです。

• 代謝物および補因子中の内因性アルデヒドまたはケトンとの競合により、収量が低下し、特異性が低下します。
• 酸化や内因性求核剤の望ましくない付加などの副反応。
• 十分に安定した生成物を形成するプローブの拘束されたセット。^{[6] [7]}

したがって、アルデヒドとケトンは、そのような望ましくない副反応が減少する区画で使用するのが最適です。生細胞での実験では、細胞表面と細胞外空間が典型的なフィールド領域です。それでも、カルボニル基の特徴は、求電子剤として関与する有機反応が膨大であることです。これらの反応のいくつかは、アルデヒドをプローブするためのライゲーションに容易に変換できます。Agarwal らによって最近バイオコンジュゲーションに使用された反応は、ピクテ-スペングラー反応をライゲーションとして適応させたものです。この反応は天然物生合成経路から知られており^[8]、新しい炭素-炭素結合を形成するという大きな利点があります。これにより、同様の反応速度論を持つ炭素-ヘテロ原子結合と比較して、長期安定性が保証されます。^[9]

FGEによるシステイン、またはまれにセリン^[10]の修飾は、1990年代後半に発見された珍しい翻訳後修飾です。 ^[11] FGEの欠損は、スルファターゼが機能を果たすために不可欠なα-ホルミルグリシンの形成が欠如しているため、機能的なスルファターゼの全体的な欠損につながります。FGEはタンパク質修飾に不可欠であり、ネイティブ設定で高い特異性と変換率が必要であるため、この反応は化学生物学および合成生物学に適用できます。^[12]

アルデヒドタグは、2007年に初めて、目的のタンパク質の改変スルファターゼモチーフペプチドに挿入されました。^[13]それ以来、バイオオルソゴナルアプリケーションにおける化学レポーターとしてのアルデヒドとケトンの同様の使用は、細胞溶解薬の自己組織化、^[14]タンパク質の標的化、^{[15] [5]}だけでなく、グリカン^[16]およびヘテロ二機能性融合タンパク質の調製においても実証されています。^[17]

ホルミルグリシンタグまたはアルデヒドタグは、目的のタンパク質に融合される、便利な6または13アミノ酸長のタグです。6マータグは小さなコアコンセンサス配列を表し、13マータグはより長い完全モチーフを表します。遺伝子コード化アルデヒドタグの実験では、コアコンセンサス配列のみが存在する場合の高い変換効率が明確に示されました。4つのタンパク質がE.coliで組み換え生産され、完全長モチーフでは86%の効率、6マーでは質量分析によって測定された90%を超える効率でした。^[3] 配列のサイズは、一般的に使用される6x His-Tag ^{[18]に類似しており、遺伝子コード化もできるという利点があります。配列は}、一次配列のみに応じてERで認識され、その後FGEによって標的とされます。^{[11]特に、} E.coliでの組み換え発現タンパク質のセットアップでは、外因性FGEの共発現が完全な変換を助けますが、 ^[3] E.coliは内因性FGE活性を持っています。^[19] アルデヒドタグの導入には、3つのセグメントからなるワークフローがあります：Aスルファターゼモチーフ由来のペプチドタグを持つ融合タンパク質の発現、BCysからf(Gly)への酵素変換、Cヒドラジドまたはアルコキシアミンによる生体直交プローブ化（図1）。

図1に示すように、設計されたアルデヒドタグは6つのアミノ酸で構成されています。生命のあらゆる領域から一連の生物が選択され、スルファターゼモチーフの配列相同性が決定されました。使用された配列は、細菌、古細菌、線虫、高等脊椎動物に見られる配列の最良のコンセンサスです。^[3]

FGE の触媒機構は十分に研究されている。共有結合酵素: 基質中間体による多段階酸化還元反応が提案されている。システイン残基が、発生する変換に果たす役割は、システインをアラニンに変異させることによって研究された。変異ペプチドタグを使用した場合、質量分析法では変換は見られなかった。^{[3]この機構は、}図 2に示すように、システインの酸化還元活性チオール基がf(Gly) の形成に重要な役割を果たしていることを示している。触媒サイクルの重要なステップは、酵素のシステイン残基の一酸化であり、反応性の高いスルフェン酸中間体が形成される。続いて、ヒドロキシル基が基質のシステインに転移し、H ₂ Oのヘテロ類似β 脱離後にチオアルデヒドが形成される。この化合物は非常に反応性が高く、容易に加水分解され、アルデヒドと H ₂ S分子を放出する。^{[20] [21] [12]}

アルデヒドタグは、バイオ直交化学レポーターの導入により、最近^{[いつ? ]}応用が広がった技術です。バイオ直交剤には、細胞内に天然には存在しないアジドやシクロオクチンなどの官能基が含まれています。異物であるため不活性に見え、天然の代謝を妨げません。 ^{[3] [7] [9]} 図3は、ホルミルグリシンの可能な標識方法の概要を示しています。たとえば、ビオチンなどのプローブや、精製や検出に有用なFlagなどのタンパク質タグに結合できます。^{[3] [1]}さらに、蛍光体を生細胞イメージング用に直接結合できます。^[22]ポリエチレングリコール(PEG)鎖を潜在的な薬物候補に結合すると、体液中のプロテアーゼに対する安定性が高まり、同時に腎クリアランスと免疫原性が低下します。^[3]ここで説明する最初の用途は、バイオ直交プローブを介したタンパク質-タンパク質複合体の形成を扱っています。^[23]アルデヒドタグは厳密に言えば、様々な代謝物中に見られる真のバイオオルトゴナルエージェントではないため、タンパク質標識中に交差反応を引き起こす可能性があります。^{[16] [23]}しかし、アジドやシクロオクチンなどのバイオオルトゴナルプローブを結合することで、この障害を克服することができます。^[23] 2番目の用途として、タンパク質へのグリカン部分の結合がここで紹介されています。これは、化学的に導入されたグリコシル化パターンの戦略に利用できます。^[24]

研究では、アルデヒドタグの助けを借りてタンパク質-タンパク質複合体を生成する戦略が検討されています。^[23]その目的は、全長ヒトIgG（hIgG）をヒト成長ホルモン（hGH）に結合することでした。これらのタンパク質-タンパク質複合体は、タンパク質治療における血清半減期の点で単量体タンパク質よりも優れている可能性があり、さらに魅力的な二重結合特性を持っています。^[24] タンパク質融合を達成するために、5残基のアルデヒドタグ（CxPxR）がhIgGとhGHに組み入れられました。hIgGでは、アルデヒドタグが2つの重鎖のC末端に導入され、2つの結合部位が可能になりました。次に、FGEはタンパク質発現中にシステイン残基をホルミルグリシン（fGly）に酸化します。その後の結合ステップでは、銅を使用しないクリックケミストリーの戦略が選択されました。ひずみ促進1,3-双極子付加環化反応によりシクロオクチンとアジドが共有結合を形成した（Cuフリーアジド-アルキン付加環化反応とも呼ばれる）。^[23]このように、アルデヒド含有タンパク質は、一方の端にアミノオキシ残基を持ち、もう一方の端にアジドまたはシクロオクチンを持つさまざまなヘテロ二官能性リンカーとオキシム形成下で反応する。これにより、hIgGがシクロオクチン（ここではジベンゾアザシクロオクチン（DIBAC））を含むリンカーに、hGHがアジド機能を持つリンカーに結合します（図 2AおよびB）。タンパク質hGHおよびhIgGはDIBAC-488、アジドAlexa Fluor 647で処理され、オキシム形成を検証するためにSDS-PAGEおよびウェスタンブロットで分析されました。次に、DIBAC-hIgG とアジド-hGH 誘導体を Cu フリークリックケミストリーで結合します (図 2C )。得られた融合タンパク質を精製し、免疫ブロット法で分析しました (Hudak et al. 2012 を参照)。

ウエスタンブロットは、まずポンソーで染色し、次に hGH に対する IgG 抗体でインキュベートし、続いて α-mIgG HRP と α-hIgG 647 で処理して可視化しました。hIgG-hGH 結合ウエスタンブロット (非還元条件) では、免疫検出後に分子量の異なる 2 つの別々のバンドが確認できます。これらは、hIgG へのモノ結合および二重結合 hGH の形成に寄与している可能性があります。

自然は、何千年にもわたる酵素と炭水化物の複雑な相互作用を通じて、タンパク質のグリコシル化を完成させてきました。しかし、化学的なグリコシル化は、グリカン全般の合成が難しいため、依然として障害となっています。^[25]炭水化物誘導体の合成は時間がかかり、面倒な場合があります。^[26]それにもかかわらず、タンパク質のグリコシル化を構造的に模倣する技術への関心は、一部のタンパク質機能が結合したグリカンのパターンにのみ依存するため、魅力的な用途です。^[27]たとえば、IgG抗体のFcフラグメントは、高度に保存されたNグリコシル化部位を持つホモ二量体です。結合した糖部分は、特定の免疫受容体への結合を調節し、それによって抗体の機能全体を変更します。^{[28] [29]}

スミスらは、グリカンの化学結合部位としてのアルデヒドタグの応用を実証している。^[22]アルデヒドタグ配列をFc構築物に組み込んで、CHO（チャイニーズハムスター卵巣）細胞に導入した。対照として、システイン残基がアラニンに変異した遺伝子構築物を使用した。発現後、Fcタンパク質をタンパク質A / Gアガロースカラムを使用して精製した。CHO細胞におけるシステインからホルミルグリシンへの変換を、アミノオキシAlexaFluor 488とそれに続くSDS-PAGEを使用して調べた。しかし、蛍光スキャンでは蛍光標識は示されず、CHO細胞における内因性FGEによるホルミルグリシンの形成は見られなかった。次に、未改変タンパク質をin vitroでMycobacterium tuberculosis由来の組み換えFGEで処理したところ、アルデヒド基がFcのグリコシル化部位に正常にインストールされた（図3A）。

次に、アミノオキシ GlcNAc (AO-GlcNAc) 処理により、オキシム形成を介したアルデヒドタグタンパク質への N-アセチルグルコサミン (GlcNAc) の導入を行った (図 3B )。結合は、液体クロマトグラフィー-エレクトロスプレーイオン化質量分析 (LC-ESI-MS) および AlexaFluor 647 に結合した GlcNAc 結合小麦胚芽凝集素を用いたレクチンブロットによって確認した。GlcNAc の導入に成功したため、モノマーは GlcNAc、マンノース (Man)、およびガラクトース (Gal) を含むグリカン構造で延長された (図 3C )。変異エンドグリコシダーゼ EndoS (EndoS-D233Q) は、IgG Fc N 結合 GlcNAc 残基に非常に特異性があり、他のタンパク質または変性 IgG 上の Asn-GlcNAc 部位を伸長しないため、使用されました。生成物の形成は、フルオレセインイソチオシアネートに結合したシアリン酸結合ニワトコ凝集素を使用して、LC-ESI-MS およびレクチンブロットプローブによって再度監視されました。

Fc IgGフラグメントの化学的グリコシル化に成功し、これは自然に発生するグリコシル化パターンに類似している。上記の研究はIgG抗体に焦点を当てたものであったが、グリカン結合のためのアルデヒドタグの応用は他のタンパク質にも拡張できる可能性がある。^[22]