ディスク拡散テスト

ディスク拡散試験（寒天拡散試験、カービー・バウアー試験、ディスク拡散抗生物質感受性試験、ディスク拡散抗生物質感受性試験、KB試験とも呼ばれる）は、診断および創薬研究室で使用される培養ベースの微生物学アッセイである。診断研究室では、このアッセイは、患者の感染症から分離された細菌の臨床的に承認された抗生物質に対する感受性を決定するために使用される。これにより、医師は最も適切な抗生物質治療を処方することができる。^{[1] [2] [4] [5]} 創薬研究室、特にバイオプロスペクティング研究室では、このアッセイは、生物学的材料（植物抽出物、細菌発酵ブロスなど）および抗菌活性を有する薬物候補をスクリーニングするために使用される。バイオプロスペクティングの際には、このアッセイを細菌のペア株で実行して、デレプリケーションを達成し、抗菌作用機序を暫定的に特定することができる。^{[6] [7]}

診断研究室では、患者の感染症から分離された細菌を寒天培地の表面に接種して検査を行う。次に、抗生物質を含んだ紙のディスクを寒天培地に塗布し、培地を培養する。抗生物質が細菌の増殖を止めるか、細菌を死滅させると、ディスクの周囲に細菌が目視できるほど増殖していない領域ができる。これを阻止域と呼ぶ。細菌分離株の各抗生物質に対する感受性は、これらの阻止域の大きさを、抗生物質感受性、中等度感受性、耐性細菌に関する既知の情報データベースと比較することで、半定量化できる。このようにして、患者の感染症の治療に最も適した抗生物質を特定することができる。^{[1] [2]ディスク拡散試験は、静菌活性と殺菌活性を区別するために使用することはできませんが、}ブロス希釈法 などの他の感受性試験方法よりも煩雑ではありません。^[4]

創薬研究室では、ディスク拡散試験は診断研究室とは少し異なる方法で実施されます。この設定では、特性評価する必要があるのは細菌株ではなく、試験抽出物（植物または微生物抽出物など）です。したがって、寒天培地に既知の表現型の細菌株（多くの場合、ATCCまたはNCTC株）を接種し、試験抽​​出物を含むディスクを表面に塗布します。^{[6]異なる抽出物には異なる拡散特性（異なる}分子サイズ、親水性など） を持つ分子が含まれているため、阻止域のサイズは抗菌効力の半定量的尺度として使用することはできません。ただし、阻止域のサイズは複製解除の目的で使用できます。これは、各抽出物を細菌のペアの株に対して試験することによって達成されます（例：ストレプトマイシン感受性株と耐性株を使用して、ストレプトマイシン含有抽出物を特定します）。ペアの株（例：野生型株と標的過剰発現株）を使用して、抗菌作用メカニズムを特定することもできます。^{[6] [7]}

寒天拡散法は、 1889年にマルティヌス・ベイエリンクが細菌の増殖に対するオーキシンの効果を研究するために初めて使用しました。しかし、この方法は、ジョージ・F・レディッシュ、ノーマン・ヒートリー、ジェームズ・G・ヴィンセント、^[8]アルフレッド・W・バウアー、ウィリアム・MM・カービー、ジョン・C・シェリス、^{[4] [5]}ハンス・マーティン・エリクソン、世界保健機関、臨床検査基準協会、スウェーデン抗生物質基準グループ、ドイツ規格協会、英国抗菌化学療法学会など、多くの科学者や科学組織によって長年にわたって開発、改良、標準化されてきました。^[8]

純粋な細菌培養物を生理食塩水に懸濁し、その濁度を標準化し、寒天プレート全体に均一に塗布します。次に、抗生物質または抽出物を染み込ませたろ紙ディスクを寒天の表面に置きます。ディスクの成分がろ紙から寒天に拡散します。これらの成分の濃度はディスクの近くで最も高く、ディスクからの距離が長くなるにつれて低くなります。抗生物質または抽出物が特定の濃度で細菌に対して有効である場合、寒天中の濃度が有効濃度以上である場所ではコロニーは成長しません。これが阻止域です。一般に、阻止域が大きいほど、その細菌株に対する抗生物質または抽出物の最小発育阻止濃度(MIC) が低くなります。^[1] 例外は、抗生物質または抽出物の分子が大きいか疎水性である場合で、これらは寒天中をゆっくりと拡散します。^[6]

カービー・バウアー法のあらゆる側面は、一貫性と正確性を確保するために標準化されています。このため、研究室はこれらの基準を遵守する必要があります。カービー・バウアー試験で使用する培地は、100 mm または 150 mm のペトリ皿に注いだ 4 mm の深さのミュラー・ヒントン寒天培地でなければなりません。寒天培地のpHレベルは 7.2 ～ 7.4 である必要があります。細菌接種物は、培養液を 0.5マクファーランド濁度標準に一致するように希釈して準備します。これは、1 mL あたり約 1 億 5000 万個の細胞に相当します。 ^[1]

無菌技術を使用して、特定の微生物のブロス 培養物を滅菌 スワブで収集します。グラム陰性細菌の場合は、チューブの内側にスワブを軽く押し付けるか回転させて余分な液体を取り除きます。次に、スワブをミュラーヒントン寒天プレート全体に塗り、細菌の芝生を形成します。均一な成長を得るために、寒天プレートをスワブで一方向に塗り、120°回転させて再度塗り、さらに120°回転させて再度塗ります。次に、抗生物質ディスクディスペンサーを使用して、特定の抗生物質を含むディスクをプレートに適用します。これは、接種後15分以内に行う必要があります。火炎滅菌したピンセットを使用して、各ディスクを寒天に軽く押し付け、確実に接着させます。次に、プレートを通常35°Cの温度で一晩インキュベートします。抗生物質ディスクを適用してから15分以内にプレートをインキュベートする必要があります。^[1]

ディスク拡散法には、病院の診断研究室で使用されるオックスフォードペニシリンカップ法やEテスト法^{[9] [10]}、医薬品の発見や開発の研究室で使用されるウェル拡散法、シリンダー拡散法、バイオオートグラフィー法など、いくつかのバリエーションが開発されています。^{[6] [11]}

抗生物質濃度が上昇するディスクを寒天培地の表面に植えたバクテリアの群落上に置き、プレートを培養する。ゾーンのサイズは、ディスクの端から透明ゾーンの端まで測定される。感受性の異なる集団の場合、解釈はより複雑になる。これらは、ディスク内の抗生物質濃度の自然対数の関数として、直線寸法または距離の二乗としてプロットされる。MIC は、データに当てはめた線形回帰のゼロ切片から決定される。^[12] 切片自体は MIC の対数である。回帰直線の傾きは、寒天培地中の特定の抗生物質の拡散係数と関連している。^[9]

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  寒天拡散法は1889年にMartinus Beijerinckによって初めて使用されました。^[8]
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  寒天拡散試験の結果のクローズアップ
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  セラチア・マルセセンスの抗生物質グラム。各ディスクには、含まれる抗生物質のラベルが付いています（例：AMC30、アモキシシリン/クラブラン酸30 μg ）。

• 抗生物質感受性試験
• ダブルディスク拡散試験
• エテスト