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ラベルフリー定量法は、質量分析法の一種で、 2つ以上の生物学的サンプル中のタンパク質の相対量を決定することを目的としています。他のタンパク質定量法とは異なり、ラベルフリー定量法では、安定同位体を含む化合物を使用してタンパク質に化学的に結合させて標識することはありません。[ 1 ] [ 2 ]
ラベルフリー定量法は、前駆イオン信号強度に基づく方法とスペクトルカウントに基づく方法がある。前者の方法は、次世代の飛行時間型質量分析計（ToF）、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計（FTICR）、またはOrbitrap質量分析計を用いて得られるような高精度質量スペクトルに適用する場合に有効である。高分解能により、MS 1レベルでのペプチド信号の抽出が容易になり、定量化と同定プロセスが分離される。一方、スペクトルカウントは、異なる生物学的サンプル中の特定のペプチドについて同定されたスペクトルの数を単純にカウントし、定量化対象のタンパク質のすべての測定ペプチドについて結果を統合する。
ラベルフリーアプローチの計算フレームワークには、ペプチドの検出、複数のLC-MSデータ間で対応するペプチドのマッチング、識別ペプチドの選択が含まれます。[ 3 ] [ 4 ]
インタクトタンパク質発現スペクトロメトリー（IPEx）は、米国食品医薬品局食品安全応用栄養センターの分析化学グループなどが開発中の、質量分析におけるラベルフリー定量法です。インタクトタンパク質は、通常プロファイルモードの四重極飛行時間型LCMS装置で分析され、データ削減ソフトウェアを使用して完全なタンパク質プロファイルが決定および定量されます。初期の結果は非常に有望です。ある研究では、哺乳類サンプルからの2つの処理反復グループ（同様の処理履歴を持つ異なる生物ですが、技術的反復ではありません）が数十の低CVタンパク質バイオマーカーを示し、IPExがタンパク質発現の研究に実行可能な技術であることを示唆しています。[ 5 ]
通常、ペプチド信号はMS1レベルで検出され、その特徴的な同位体パターンによって化学ノイズから区別されます。これらのパターンは保持時間軸に沿って追跡され、単一同位体ペプチド質量のクロマトグラフィー溶出プロファイルを再構築するために使用されます。ペプチド信号の全イオン電流は積分され、元のペプチド濃度の定量的測定値として使用されます。検出された各ペプチドについて、まずすべての同位体ピークが特定され、次に電荷状態が割り当てられます。
ラベルフリー定量法は前駆イオンのシグナル強度に基づいている場合があり、分離干渉による問題があります。ハイスループット研究では、測定対象のペプチド前駆イオンが、m/z比が類似していて、溶出時間が重複する全く別のペプチドである可能性が容易にあります。スペクトルカウント法は、ペプチドが同定されるため、追加のMS/MSスキャンを実行する必要があり、時間がかかるため実験の解像度が低下するという問題があります。
差分標識法とは対照的に、ラベルフリー実験では、すべての生物学的試料を個別に測定する必要があります。抽出されたペプチドシグナルは、質量電荷比と保持時間という次元上の座標を用いて、複数回または複数回のLC-MS測定にわたってマッピングされます。高精度質量分析計からのデータは、このプロセスを大幅に簡素化し、複数の測定間で正しいペプチドシグナルを照合する確実性を高めます。
生物学的サンプルの処理方法が異なる場合、結果を補正するための標準物質が必要となることは明らかです。異なる生物学的サンプル間で発現レベルが変化しないと予想されるペプチドは、この目的に使用できます。ただし、すべてのペプチドが良好にイオン化されるわけではないため、候補となるペプチドの選択は、調査対象となる生物学的サンプルのタンパク質含有量のみを特徴付ける初期研究を行った後に行う必要があります。
最後に、高度な正規化手法を用いて、LC-MS測定間のペプチド強度値における系統的なアーチファクトを除去します。そして、複数のサンプル群間で正規化強度が異なる（例えば、p値＜0.05）ペプチドを選択することで、識別可能なペプチドを特定します。
さらに、LTQ OrbiTrapのような最新のハイブリッド質量分析計では、MS1レベルでのペプチドの高精度質量測定と並行して、MS/MSによるペプチド同定を行うことが可能です。これにより、これら2つの情報源の処理と統合における計算上の課題が増大し、有望な新規定量化戦略の開発につながっています。