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ランオフ転写アッセイは、分子生物学におけるアッセイであり、特定のプロモーターの転写開始部位（1塩基対上流）の位置と、その精度およびin vitro転写速度を特定するためにin vitroで実施される。[1] [2] [3]
ランオフ転写は、プロモーター領域の変化がin vitro転写レベルに及ぼす影響を定量的に測定するために使用できます。 [1] [2] [4]ただし、in vitroの性質上、このアッセイでは、核ランオンなどのin vivoアッセイとは異なり、細胞特異的な遺伝子転写速度を正確に予測することはできません。[1] [2]
ランオフ転写アッセイを行うには、プロモーターを含む目的の遺伝子をプラスミドにクローニングします。[4]プラスミドは、転写開始部位の下流にある既知の制限酵素切断部位で消化され、予想されるmRNAランオフ産物がゲル電気泳動によって簡単に分離されます。[1] [2] [4]
このアッセイを実行する前に、DNAを高度に精製する必要がある。[1] [2] 転写を開始するために、放射性標識UTP、他のヌクレオチド、およびRNAポリメラーゼを線状DNAに加える。[1] [2 ]転写は 、 RNAポリメラーゼがDNAの末端に達するまで続き、そこでDNAテンプレートから「流れ落ち」、定義された長さのmRNA断片となる。[1] [2]この断片は、サイズ標準とともにゲル電気泳動で分離し、オートラジオグラフィーにかけることができる。[1] [2] [4]バンドの対応するサイズは、制限酵素切断部位から転写開始部位（+1）までのmRNAのサイズを表す。[4]バンドの強度は、生成されたmRNAの量を示す。[4]
さらに、特定の条件下（異なる化学物質の存在下）で転写が行われているかどうかを検出するためにも使用できます。[5]
参考文献
- ^ abcdefgh Loewenstein, PM; Song, CZ; Green, M (2007).ウイルスタンパク質ドメインの調節機能を調べるためのin vitro転写の使用。分子医学の方法。第131巻。pp. 15–31。doi : 10.1007/ 978-1-59745-277-9_2。ISBN 978-1-58829-901-7. PMID 17656772。
- ^ abcdefgh 「Run-off Transcription」。Molecular Station。2014年4月22日時点のオリジナルよりアーカイブ。2014年4月16日閲覧。
- ^ Lelandais, C; Gutierres, S; Mathieu, C; Vedel, F; Remacle, C; Maréchal-Drouard, L; Brennicke, A; Binder, S; Chétrit, P (1996). 「ランオフ転写で活性なプロモーター要素が Nicotiana sylvestris ミトコンドリアの nad および rps 遺伝子の 2 つのシストロンの発現を制御する」Nucleic Acids Research . 24 (23): 4798–804. doi :10.1093/nar/24.23.4798. PMC 146301 . PMID 8972868.
- ^ abcdef Allison, Lizabeth. 「基礎分子生物学、第11章」(PDF)。BlackWell Publishing 。 2014年4月18日閲覧。
- ^ Sanchez, Alvaro; Osborne, Melisa L.; Friedman, Larry J.; Kondev, Jane; Gelles, Jeff (2011). 「単一分子の分析による細菌プロモーターでの転写抑制のメカニズム」. The EMBO Journal . 30 (19): 3940–3946. doi :10.1038/emboj.2011.273. PMC 3209775. PMID 21829165 .