細胞死の特定

細胞死の識別基準は変化した。 細胞死はかつて形態に基づいて定義され、説明されていた。現在では分子および遺伝学的定義に基づいて分類する方向に転換している。この説明はより機能的で、in vitroとin vivo の両方に適用できるため、細胞死のサブルーチンは現在、一連の正確で測定可能な生化学的特徴によって説明される。細胞死の用語を説明する一連の推奨事項は、言葉や概念の誤用が細胞死研究の分野での進歩を遅らせる可能性があるため、2009年に細胞死命名委員会 (NCCD) によって提案された。^[1]

死の典型的な定義は、生命の兆候が停止した状態と定義されています。死とは、細胞がその細胞膜の完全性を失った場合、および/または細胞核を含む完全な崩壊を起こした場合、および/または細胞断片が生体内で近隣の細胞に飲み込まれた場合です。死は、システムの内部組織の不可逆的な機能的不均衡と崩壊によって引き起こされます。細胞死の役割は、組織と臓器の恒常性の維持であり、たとえば皮膚細胞の定期的な損失や、胸腺などの退縮組織に見られるより積極的な役割などがあります。

細胞は、偶然または意図的に死にます。実際、細胞死には壊死とアポトーシスの 2 つのメカニズムがあります(無脊椎動物のアポトーシスは細胞消失と呼ばれます)。死にゆく細胞は、最初の不可逆段階または「後戻りできないポイント」を超えるまでは、可逆的なプロセスに陥ります。

壊死は細胞のプログラムされていない死であり、初期の細胞膜の変化がカルシウムとナトリウムの不均衡につながる。これにより、アシドーシス、浸透圧ショック、クロマチンの凝集、核濃縮が起こる。これらの変化は、酸化的リン酸化の喪失、ATP 生成の低下、恒常性維持能力の喪失を伴う。また、カルシウム過負荷やホスホリパーゼの活性化などのミトコンドリアの変化もあり、膜拡散シグナルを引き起こし、不可逆的な損傷の段階となる。第 2 段階では、リソソームの膨張、小胞体の拡張、酵素とタンパク質の漏出、区画化の喪失が起こる。

アポトーシス、つまりプログラム細胞死は、一般的に、明確な形態学的特徴とエネルギー依存の生化学的メカニズムによって特徴付けられます。アポトーシスは、正常な細胞ターンオーバー、免疫系の適切な発達と機能、ホルモン依存の萎縮、胚の発達、化学物質による細胞死など、生命のさまざまなプロセスに不可欠な要素であると考えられています。たとえば、発達中のヒトの胚における手指と足指の分化は、指の間の細胞がアポトーシスを起こして別々の指になるために起こります。

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形態計測法は、実験室で細胞死を証明する方法です。形態計測は、細胞死の発生前と発生後を比較した組織、臓器、生物全体の体積、サイズ、重量、長さとして細胞死の結果を提供します。^[2]この方法は、電子粒子分析を使用して細胞生存率を決定したアタラとジョンソンによって観察されました。

細胞死のもう一つの指標は酸加水分解であり、これはマクロファージまたは隣接細胞による死細胞の貪食中に消化によって放出され、生体内染料は二次貪食のマーカーとなります。

細胞死を証明するために、場合によっては、細胞機能が破壊されたことを検出するのに生体染色剤が使用されます。この手順では、生理食塩水中のナイルブルー硫酸塩の 1:0000 希釈溶液に浸した生体組織を使用します。この染色剤を使用した細胞死の測定は、色の変化または蛍光の形成を観察することです。細胞が死ぬと、核は破壊段階を経ます。その 1 つがピクノーシスで、これにより基本的なヒストン グループが放出されます。これは、クロマチンの不可逆的な凝縮が起こったときに起こります。貪食プロセスは二次リソソームで起こり、オートファジーとヘテロファジーが酸加水分解活性によって死細胞を制御しました。これを説明するために使用される技術は、クライオスタットでの (6-3H)-チミジンと酸性リン酸の活性の検出です。

標本に (6-3H)-チミジンを注入し、組織を屠殺し、1 時間後に摘出して液体窒素で急冷した。次に 4 μm のクライオスタット切片を切り出し、清潔なカバーガラスに載せ、カバーガラスを切片とともにクライオスタット内に保持し、冷アナラーアセトンで 10 分間固定し、酸性リン酸培地でインキュベートした緩衝液でカバーガラスをすすいだ (15 分間)。ナフトールAS TR リン酸^[3]を基質として使用し、ヘキサゾニウム パラオサニリンをカップラーとして使用した。再び切片を蒸留水で十分にすすぎ、切片をオートラジオグラフィー乳剤 (I1ford L4 を 1:5 に希釈) に浸した。標本は暗室で 2 ～ 3 週間 (0 ～ 4 °C) に曝露した。写真スライドを処理し、ヘマトキシリンで対比染色し、顕微鏡用に載せた。

この実験の結果は、上で行ったアゾ染料技術によって生じた赤色であり、これは細胞の自己分解が起こったことを示す指標です。これが形態計測法の主な目的でした。もう 1 つは、写真乳剤中に銀粒子が生成されたことです。

この色の変化は、酸性ホスファターゼ活性の微細で均一な赤色反応によるものです。リソソームには、遊離加水分解酵素のような細胞死の兆候がたくさんあります。トリチウム化チミジンを組み込むと、細胞核で発生した銀粒子が写真乳剤に生じます。この手順に最適な組織は胸腺組織です。この議論では、研究例としてマウスの胸腺で発生する 2 つの変化に焦点を当てます。最初の変化は、死にかけている細胞 (拡散酸性ホスファターゼ) の割合であり、2 番目はチミジンを取り込んでいる細胞 (DNA を合成している細胞) です。結果は、マウスの年齢に従って比較されます。比率と数を測定した後、退縮胸腺の細胞死のレベルは若い胸腺と比較して 2 倍になり、古い胸腺では若い胸腺と比較してチミジンが減少したという結論に達しました。これらの結果をさらに示すために、一部の胸腺細胞には酸性ホスファターゼ活性のリソソーム部位が含まれていることが観察されました。マクロファージが死にかけている細胞を飲み込むと、酸性ホスファターゼのレベルが上昇しました。

ルイスは、3H-チミジンのオートラジオグラフィーによる取り込みを利用して、有糸分裂指数を計算し、核濃縮指数を推定しました。この技術は、腫瘍の組織動態を研究するために使用でき、走査型電子顕微鏡に応用されています。^[4]

走査型電子顕微鏡は、Hodges と Muir (1975) によってオートラジオグラフの研究に採用されました。このアプローチは、遊離酸リン酸と細胞溶解を実証するための細胞化学的方法と組み合わされました。遊離酸リン酸に富む死にかけている細胞は臭素化反応生成物を含み、X 線マイクロアナリシスにかけると臭素の特徴的な信号を示します。微細構造の研究死にかけている細胞では、共通の微細構造変化が発生します。これは、脊椎動物のアポトーシスの一般概念を提唱した Kerr (1972) などの科学者によるいくつかの試みの後に結論付けられました。一方、Scheweichel と Merker (1973) は、出生前マウス組織における誘導性および生理学的細胞死について説明しました。微細構造の区別を使用すると、細胞死のタイプ、酸性リン酸と細胞削除を認識して区別することができます。

酸性リン酸は、細胞死の証明に使用できる酵素またはイソ酵素のグループであり、電子顕微鏡で簡単に観察できます。p-ニトロフェニルリン酸活性は、細胞死の優れたマーカーとして使用できます。このマーカーは、胚発生中の細胞内の細胞死の位置を特定するために使用されており、その結果、細胞外質の非リソソーム酸性リン酸が放出されることが観察されました。これは、細胞死の兆候として現れます。放出された細胞外質のp-ニトロフェニルリン酸は、リソソームではなく リボソームに関連していることを示す実験が多数あります。

プログラム細胞死は、そのプロセスの遺伝子制御を意味するため、発達の過程で細胞死を指定する遺伝子が存在する必要があります。多くの著者は、プログラム細胞死の前兆としてタンパク質合成の増加が起こる可能性があることを示しています。