レーザーマイクロダイセクション

レーザー捕捉マイクロダイセクション（LCM）は、マイクロダイセクション、レーザーマイクロダイセクション（LMD）、またはレーザーアシストマイクロダイセクション（LMDまたはLAM ）とも呼ばれ、組織/細胞/生物の微小領域から特定の目的細胞を分離する方法です^{[ 1 ] [ 2 ]}（レーザーの助けを借りて微小スケールで解剖します）。

レーザーマイクロダイセクション（LCM）は、顕微鏡で直接観察しながら組織細胞のサブポピュレーションを採取する方法です。LCM技術は、目的の細胞を直接採取することも、不要な細胞を切り取って特定の細胞を分離し、組織学的に純粋な濃縮細胞集団を得ることもできます。下流のアプリケーションは多岐にわたり、DNAジェノタイピングとヘテロ接合性喪失（LOH）解析、RNA転写産物プロファイリング、cDNAライブラリー生成、プロテオミクス発見、シグナル経路プロファイリングなどがあります。このプロトコルを実行するのに必要な総時間は通常1～1.5時間です。^{[ 3 ]}

レーザーは顕微鏡に組み込まれ、スライド上の組織に焦点を合わせます。光学系またはステージによるレーザーの移動により、焦点はユーザーがあらかじめ定義した軌道に沿って移動します。この軌道（要素とも呼ばれる）は、切り出されて周囲の組織から分離されます。切断後、必要に応じて抽出処理を行う必要があります。より新しい技術では、非接触マイクロ解剖が利用されています。

組織病理学的サンプルが載った顕微鏡スライドから組織を抽出する方法はいくつかあります。サンプルに粘着面を押し付けて引き剥がす方法。この方法では目的の領域を抽出できますが、表面が選択的ではないため、表面上の粒子や不要な組織も一緒に除去してしまう可能性があります。サンプルにプラスチック膜を溶かして引き剥がす方法。熱は、例えば、吸収性色素で染色した膜に赤色または赤外線（IR）レーザーを照射することによって加えられます。この方法で目的のサンプルを膜に接着させると、組織病理学的サンプルの表面に近づけた膜と同様に、破片が抽出される可能性があります。もう一つの危険は、加えられる熱です。DNA、RNA、タンパク質などの一部の分子は、可能な限り純粋に分離するという目的のために、過度に加熱したり、加熱を全く行わなかったりすることを許容しません。

非接触輸送の場合、3つの異なるアプローチがあります。直立顕微鏡を使用した重力による輸送（GAM、重力補助マイクロダイセクションと呼ばれる）またはレーザー圧力カタパルトによる輸送。最新世代は、レーザー誘起前方転送（LIFT）に基づく技術を利用しています。カットアンドキャプチャでは、接着剤でコーティングされたキャップが、薄く切断された（5～8  μm）組織切片上に直接配置され、切片自体は薄い膜（ポリエチレンナフタレン）の上に載っています。IRレーザーがキャップ上の接着剤を穏やかに加熱して下層の組織に融合させ、UVレーザーが組織と下層の膜を切断します。膜と組織の複合体はキャップに接着し、キャップ上の細胞は下流のアプリケーション（DNA、RNA、タンパク質分析）に使用できます。^{[ 4 ]}

ソフトウェアインターフェースを備えた顕微鏡下で、組織切片（通常厚さ5～50マイクロメートル）を観察し、個々の細胞または細胞クラスターを手動、半自動、また​​はより完全に自動化された方法で識別し、画像化してから分離対象を自動的に選択します。現在、顕微鏡と細胞分離装置を使用する6つの主要な分離/収集技術が存在します。これらのうち4つは、通常、紫外線パルスレーザー（355  nm）を使用して組織または膜/フィルムを直接切断し、場合によっては、細胞接着と分​​離のために粘着性ポリマーを加熱/溶融する役割を担うIRレーザーと組み合わせて使用​​します。IRレーザーは、マイクロダイセクションに対してより穏やかなアプローチを提供します。5番目の紫外線レーザーベースの技術は、エネルギー伝達コーティングが施された特殊なスライドを使用し、レーザーパルスによって活性化されると、組織または細胞を収集キャップに押し込みます。

レーザー切断幅は通常1μm未満である ため、標的細胞はレーザービームの影響を受けません。生細胞もレーザー切断によって損傷を受けず、切断後も生存可能であり、必要に応じてクローン化や再培養に利用できます。^{[ 5 ]}

各種技術は、試料採取プロセス、イメージング方法（蛍光顕微鏡、明視野顕微鏡、微分干渉顕微鏡、位相差顕微鏡など）、イメージングおよび分離前に必要なホルダーの種類や組織処理方法などが異なります。ほとんどは主にマイクロ解剖専用システムですが、一部は研究用顕微鏡としても使用できます。正立顕微鏡を使用する技術は1つ（ここでは2番目のライカ）のみで、特に生細胞を用いた作業においては、試料処理能力がやや制限されます。

最初の技術（Carl Zeiss PALM社が使用）は、サンプルの周囲を切断し、「カタパルト」技術によってサンプルを回収します。サンプルは、焦点がずれたUVレーザーパルスによってスライドまたは特殊な培養皿からカタパルトされ、光子力によってスライド/培養皿から材料が押し出されます。この技術は、レーザーマイクロダイセクション圧力カタパルト（LMPC）と呼ばれることもあります。切断された材料は、マイクロ遠心チューブのキャップまたは他のコレクターに向かって上方に（数ミリメートルまで）送られます。チューブのキャップには、緩衝液または組織が付着する特殊な粘着性材料が含まれています。この能動的なカタパルトプロセスにより、メンブレンコーティングされたスライドを使用する際に発生する静的な問題の一部が回避されます。^{[ 6 ]}

別のプロセスでは、重力補助マイクロダイセクション法が用いられ、重力を利用してスライド下のチューブキャップ内にサンプルを収集します（ION LMDシステム、Jungwoo F&Bで使用）。このシステムでは、レーザービームを固定したまま、電動ステージを動かして目的の細胞を切断します。また、このシステムでは、RNAやDNAに損傷を与えることなく組織を切断する最も安全な方法である355  nm固体レーザー（UV-A）を使用します。^{[ 7 ]}

もう一つの密接に関連するLCMプロセス（ライカ社が使用）では、サンプルを上から切断し、サンプルは重力によって（重力補助マイクロ解剖）サンプルの下にある捕捉装置に落下します。^{[ 8 ]}上記のプロセスとの違いは、ここではレーザービームがダイクロイックミラーを動かすことによって組織を切断するために移動する点です。

選択した細胞（スライドまたは特殊培養皿上）が視野の中心にあるとき、オペレーターは機器ソフトウェアを使用して目的の細胞を選択します。組織サンプルに置かれたキャップ上の転写フィルムを近赤外線レーザーで活性化し、接着剤を溶かしてフィルムを目的の細胞と融合させることで分離する領域（Arcturusシステムを参照）と、および/またはUVレーザーを活性化して目的の細胞を切り出すことによって分離します。次に、細胞は薄い組織切片から持ち上げられ、不要な細胞はすべて残ります。抽出前に、目的の細胞が観察され、記録されます。^{[ 9 ]}

4番目のUVベースの技術（Molecular Machines and Industries AGが使用）は、フレームスライドを使用し、その膜表面をレーザーで切断し、最終的に特殊な接着キャップで上から持ち上げることで、スライド＞サンプル＞サンプルの上に膜を重ねた一種のサンドイッチ構造を基本的に作成するという点で、3番目の技術とは若干の違いがある。^{[ 10 ]}

5つ目のUVベースの技術は、不活性エネルギー転送コーティングを施した標準的なガラススライドとUVベースのレーザーマイクロダイセクションシステム（通常はLeica LMDまたはPALM Zeissマシン）を使用します。組織切片はエネルギー転送コーティングの上にマウントされます。UVレーザーからのエネルギーは、コーティングに当たると運動エネルギーに変換され、コーティングを蒸発させ、選択された組織の特徴を瞬時に収集チューブに送り込みます。Expression Pathology Inc.（メリーランド州ロックビル）がDIRECTORスライドという商標名で販売しているエネルギー転送コーティングスライドは、プロテオミクス作業にいくつかの利点があります。また、自家蛍光を発しないため、蛍光染色、DIC、または偏光を使用するアプリケーションに使用できます。^{[ 11 ]}

LCMは、組織切片に加えて、生細胞／生物、細胞塗抹標本、染色体標本、植物組織にも適用できる。

レーザーマイクロダイセクション法は、採取したサンプルの形態や化学組成、および周囲の細胞を変化させたり損傷したりすることはありません。このため、LCMはDNA、RNA、および/またはタンパク質分析のために特定の細胞を採取するのに有用な方法です。LCMは、アミロイドプラークなどの無細胞構造を分離するためにも使用されています。^{[ 12 ]} LCMは、血液塗抹標本、細胞学的標本^{[ 13 ]} 、細胞培養、固形組織のアリコートなど、 さまざまな組織サンプルに対して実行できます。凍結およびパラフィン包埋された保存組織も使用できます。^{[ 14 ]}

2025年現在、レーザー支援型マイクロダイセクションシステムの主要プロバイダーはライカマイクロシステムズとMMIの2社である。かつて主要プロバイダーであったツァイスとアークトゥルスは、それぞれのシステムの販売を中止した。

• イーストカロライナ大学：LCM入門
• レーザーマイクロダイセクションを用いたイェール・ライス転写アトラスプロジェクト