生体顕微鏡検査

生体顕微鏡検査は、生きた動物（生体内）の生物学的プロセスを高解像度で観察し、組織の個々の細胞を区別することを可能にする顕微鏡検査の一種です。^[1]

哺乳類では、いくつかの実験設定において、生体顕微鏡検査の前に撮像ウィンドウの外科的移植が行われる。これにより、数日または数週間にわたって繰り返し観察が可能になる。例えば、研究者が生きたマウスの肝細胞を視覚化したい場合、マウスの腹部に撮像ウィンドウを移植する。^[2] マウスは生体顕微鏡検査に最も一般的に選択される動物であるが、特殊な場合にはラットなどの他のげっ歯類の方が適している可能性がある。動物は通常、手術および撮像セッション中ずっと麻酔をかけられる。生体顕微鏡検査は、神経学、免疫学、幹細胞研究など、いくつかの研究分野で使用されている。この技術は、病気の進行または薬物の効果を評価するのに特に有用である。^[1]

生体顕微鏡検査では、特別な手術中に動物の組織に埋め込まれた画像ウィンドウを通して、生きた動物の細胞を画像化します。生体顕微鏡検査の主な利点は、複雑な多細胞生物の実際の環境にある生きた細胞を画像化できることです。したがって、生体顕微鏡検査により、研究者は細胞培養ではなく、自然環境または生体内での細胞の挙動を研究できます。生体顕微鏡検査のもう1つの利点は、一定期間にわたる生物の生きた組織の変化を観察できるように実験を設定できることです。これは、免疫学^[3]や幹細胞研究^{[1]を含む多くの研究分野で役立ちます。現代の顕微鏡と} 画像化ソフトウェア
の高品質により、生きた動物の細胞内画像化も可能になり、その結果、生体内で分子レベルで細胞生物学を研究できます。特定の時間に特定の遺伝子を対象の組織で制御された発現を可能にする蛍光タンパク質技術と遺伝子ツールの進歩も、生体顕微鏡検査の開発に重要な役割を果たしました。^[1]

適切なトランスジェニックマウスを作製できる可能性は、生体顕微鏡研究にとって極めて重要です。たとえば、アルツハイマー病におけるミクログリア細胞の挙動を研究するには、研究者はアルツハイマー病のマウスモデルであるトランスジェニックマウスと、ミクログリア細胞の可視化のためのマウスモデルである別のトランスジェニックマウスを交配する必要があります。細胞は可視化するために蛍光タンパク質を生成する必要があり、これはトランスジーンを導入することで実現できます。^[4]

生体内顕微鏡検査は、広視野蛍光、共焦点、多光子、回転ディスク顕微鏡など、いくつかの光学顕微鏡技術を使用して実行できます。特定の技術を選択する際の主な考慮事項は、領域を画像化するために必要な浸透深度と、必要な細胞間相互作用の詳細の量です。

関心領域が表面から 50～100 μm 以上下にある場合、または細胞間の小規模な相互作用を捉える必要がある場合は、多光子顕微鏡が必要です。多光子顕微鏡は、単光子共焦点顕微鏡よりもかなり深い浸透深度を提供します。^{[5]多光子顕微鏡では、}骨髄細胞など、骨組織の下にある細胞を視覚化することもできます。^[6]多光子顕微鏡によるイメージングの最大深度は、組織と実験装置の光学特性によって異なります。組織が均質であるほど、生体顕微鏡に適しています。血管の多い組織は、赤血球が顕微鏡の光線を吸収および散乱させるため、一般的にイメージングが困難です。 ^[1]

異なる細胞系統を異なる色のタンパク質で蛍光標識すると、微小環境の状況下で細胞の動きを視覚化できます。画像の解像度が十分に高い場合（50〜100μm）、複数の画像を使用して、細胞が互いに向かって伸びるときに作る突起を含む細胞相互作用の3Dモデルを生成することができます。タイムラプス画像シーケンスからの3Dモデルにより、細胞の動きの速度と方向性を評価できます。血管構造も3D空間で再構築でき、血管透過性が変化すると染料の蛍光信号強度が変化するため、一定期間にわたって血管の透過性の変化を監視できます。高解像度の生体内顕微鏡を使用して、自発的かつ一時的なイベントを視覚化できます。[ ^1]
多光子顕微鏡と共焦点顕微鏡を組み合わせると、すべてのイメージングセッションからより多くの情報を得ることができるため、役立つ場合があります。これには、より有益な画像を得るためにより多くの異なる細胞タイプと構造を視覚化することと、特定の実験で興味のあるすべての異なる細胞タイプと構造の画像を得るために単一の動物を使用することが含まれます。^[7]後者は、3Rの原則の実装例です。

これまで、生体顕微鏡は組織または単一細胞レベルでの生物学的プロセスを画像化するためにしか使用できませんでした。しかし、細胞内標識技術の開発とモーションアーティファクト（画像化セッション中に動物の心拍、呼吸、蠕動運動によって生成されるエラー）を最小限に抑える技術の進歩により、現在では一部の組織の細胞内小器官の動態を画像化することが可能になりつつあります。 ^[1]

生体顕微鏡の主な利点の 1 つは、細胞が微小環境とどのように相互作用するかを観察できることです。しかし、微小環境のすべての細胞タイプの可視化は、利用可能な識別可能な蛍光ラベルの数によって制限されます。 ^[5]また、脳 などの一部の組織は、骨格筋などの他の組織よりも可視化しやすいことも広く認められています。これらの違いは、さまざまな組織の均質性と透明性のばらつきによって発生します。さらに、目的の表現型と適切な細胞タイプの蛍光タンパク質を持つトランスジェニックマウスを生成することは、多くの場合、困難で時間がかかります。^[5] トランスジェニックマウスの使用に関連するもう 1 つの問題は、野生型マウスと目的の表現型を表すトランスジェニックマウスの間で観察される変化を解釈することが難しい場合があることです。その理由は、同様の機能の遺伝子が、ある程度の適応につながる変化した遺伝子を補うことができることが多いためです。^[8]

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