画像粒子分析

画像粒子分析は、デジタル画像を使用して粒子測定を行う技術であり、より広い用語である粒子サイズ分析によって定義される技術の 1 つです。実行できる測定には、粒子サイズ、粒子形状 (形態または形状分析、グレースケールまたは色)、および統計的集団測定の分布 (グラフ) が含まれます。

画像粒子分析では、粒子の分析に画像分析や画像処理に共通する技術を使用します。ここでの粒子は、粒子サイズ分析に基づいて粒子状固体として定義されるため、原子粒子や亜原子粒子は含まれません。さらに、この記事は、 "合成" (コンピュータ) 画像 (コンピュータ断層撮影、共焦点顕微鏡、SIM、その他の超解像度顕微鏡技術など)ではなく、実際の画像(光学的に形成された) に限定されています。

上記を踏まえると、粒子分析を画像化する主な方法は光学顕微鏡を使用することです。光学顕微鏡は1600 年代から存在し、粒子分析に使用されてきましたが、^[1]過去の「分析」は人間の視覚システムを使用して人間によって行われてきました。そのため、この分析の多くは主観的、つまり定性的な性質を持っています。顕微鏡の測定レチクルなどの何らかの定性的なツールが利用できる場合でも、それらの測定値を決定して記録するには依然として人間が必要でした。

1800年代後半^[2]に写真乾板が利用可能になり、顕微鏡画像をフィルムや紙に永久的に記録できるようになり、ハードコピー画像に目盛り付きの定規を使用するだけで、測定値を簡単に取得できるようになりました。これにより粒子測定値の取得速度が大幅に向上しましたが、それでも面倒で労働集約的なプロセスであり、統計的に有意な粒子集団を測定することが困難であるだけでなく、プロセスにある程度の人為的エラーも発生していました。

最終的に、1970年代後半頃から、画像を撮影するためのCCDデジタルセンサーと、それらの画像を処理できるコンピュータが登場し、デジタル画像処理を使用することでプロセスに革命を起こし始めました。デジタル画像処理を実行するための実際のアルゴリズムはかなり前から存在していましたが、これらの分析を実行するために必要なかなりの計算能力が手頃な価格で利用できるようになって初めて、デジタル画像処理技術が主流になりました。最初の動的画像粒子分析システムは1982年に特許を取得しました。^[3] より高速な計算リソースがより低コストで利用できるようになったため、粒子の顕微鏡画像からの測定タスクは、人間の介入なしに機械によって自動的に実行できるようになり、はるかに多くの粒子をはるかに短時間で測定できるようになりました。

イメージング粒子分析を実行する基本的なプロセスは次のとおりです。

1. デジタルカメラは光学系で視野の画像を撮影します。
2. グレースケール閾値処理は画像分割を実行するために使用され、背景から粒子を分離し、各粒子のバイナリ画像を作成します。^{[4] [5] [6]}
3. デジタル画像処理技術を用いて画像解析操作を実行し、各粒子の形態学的およびグレースケールの測定値を保存します。^[7]
4. 各粒子について保存された測定値は、画像集団統計を生成するために使用されるか、^[8]または粒子をフィルタリングして類似の種類のグループに分類するためのアルゴリズムへの入力として 使用されます。一部のシステムでは、異種サンプルに含まれる異なる粒子タイプを分離するために、高度なパターン認識技術^{[9] [10]も使用される場合があります。}

画像粒子分析装置は、画像取得方法に基づいて、静的と動的の 2 つの異なるタイプに分類できます。基本原理は同じですが、画像取得方法は本質的に異なり、それぞれに長所と短所があります。

静止画像の取得は最も一般的な形式です。ほとんどすべての顕微鏡は、C マウントアダプターを介してデジタル カメラを受け入れるように簡単に調整できます。このタイプのセットアップは、多くの場合デジタル顕微鏡と呼ばれますが、この名前を使用するシステムの多くは、モニターに画像を表示するためだけに使用されます。

サンプルは顕微鏡スライド上に準備され、顕微鏡ステージ上に配置される。サンプルに焦点を合わせると、画像が取得され、モニターに表示される。デジタルカメラまたはフレームグラバーがある場合は、画像をデジタル形式で保存し、画像処理アルゴリズムを使用して視野内の粒子を分離して測定することができる。^{[11] [12]}

静止画像取得では、一度に 1 つの視野画像のみがキャプチャされます。スライド上の同じサンプルの他の部分を画像化したい場合は、XY 位置決めハードウェア (通常は顕微鏡上の 2 つのリニア ステージで構成) を使用してスライドの別の領域に移動できます。同じ粒子を複数回カウントして測定しないように、2 つの画像が重ならないように注意する必要があります。

静止画像取得の主な欠点は、サンプルの準備（必要に応じて適切な希釈でサンプルをスライドに載せる）と、統計的に有意な数の粒子を取得してカウント/測定できるようにするためのステージの複数回の移動の両方に時間がかかることです。これらのシステムでは、プロセスを高速化し、オペレーターの介入を減らすためにコンピューター制御のXY位置決めステージが使用されることがありますが、それでも時間のかかるプロセスであり、高倍率で作業するときに必要な精度のレベルのために電動ステージは高価になる可能性があります。^[13]

静的粒子イメージングシステムの主な利点は、標準的な顕微鏡システムを使用できることと、被写界深度を考慮する必要がないことです。これらのシステムは標準的な光学顕微鏡から作成できるため、すでに顕微鏡を持っている人にとっては低コストのアプローチとなる可能性があります。しかし、より重要なのは、顕微鏡ベースのシステムでは、動的イメージングシステムに比べて被写界深度の問題が一般的に少ないことです。これは、サンプルが顕微鏡スライド上に置かれ、通常はカバーガラスで覆われるため、光軸に対する粒子を含む平面が制限されるためです。つまり、高倍率でより多くの粒子が適切な焦点に収まることになります。^[13]

動的画像取得では、サンプルを顕微鏡の光学系を通過させ、高速フラッシュ照明を使用してサンプルの動きを効果的に「凍結」することで、大量のサンプルを画像化します。フラッシュはカメラの高速シャッター速度と同期され、モーションブラーをさらに防止します。乾式粒子システムでは、粒子はシェーカー テーブルから分配され、重力によって光学系を通過して落下します。流体画像粒子分析システムでは、右に示すように、狭いフロー セルを使用して液体が光軸を横切って通過します。

フローセルは、右の 2 番目の図に示すように、光軸に垂直な深さが特徴です。粒子の焦点を保つために、フローの深さは制限され、粒子は光軸に垂直な最適な焦点の平面に留まります。これは、静的画像システムにおける顕微鏡スライドとカバー スリップの効果と概念的に似ています。被写界深度は倍率が上がるにつれて指数関数的に減少するため、倍率が高くなるとフローセルの深さを大幅に狭める必要があります。

動的画像取得の主な欠点は、前述のようにフローセルの深さを制限しなければならないことです。つまり、一般的にフローセルの深さよりも大きい粒子は、システムを詰まらせる可能性があるため、処理中のサンプルに含めることはできません。そのため、サンプルを評価する前に、フローセルの深さよりも大きい粒子を除去するために、通常、サンプルをフィルター処理する必要があります。非常に広い範囲の粒子サイズを調べたい場合は、サンプルをより小さなサイズ範囲のコンポーネントに分割し、異なる倍率/フローセルの組み合わせで実行する必要がある可能性があります。^[13]

動的画像取得の主な利点は、通常1分あたり10,000個以上の粒子の取得と測定を非常に高速に実行できることです。これは、統計的に有意な集団を、手動顕微鏡検査や静的画像粒子分析でこれまで可能であったよりもはるかに短い時間で分析できることを意味します。この意味で、動的画像粒子分析システムは、粒子カウンターの典型的な速度と顕微鏡の識別能力を兼ね備えています。^[13]

動的イメージング粒子分析は、水生微生物研究において、2 um から 5 mm のサイズに及ぶ植物プランクトン、動物プランクトン、およびその他の水生微生物を分析するために使用されます。動的イメージング粒子分析は、300 nm から 5 mm のサイズに及ぶ粒子を特徴付け、分析するバイオ医薬品研究でもあります。

マイクロフローイメージング（MFI）は、フロー顕微鏡を使用して溶液中に含まれる粒子をサイズに基づいて定量化する粒子分析技術です。この技術は、バイオ医薬品業界で約1μmから50μmを超える目に見えない粒子を特徴付けるために使用されています。^[14]