微分干渉コントラスト顕微鏡

微分干渉コントラスト( DIC )顕微鏡法は、ノマルスキー干渉コントラスト( NIC ) またはノマルスキー顕微鏡法とも呼ばれ、染色されていない透明なサンプルのコントラストを強調するために使用される光学顕微鏡法です。DIC は、干渉法の原理に基づいてサンプルの光路長に関する情報を取得し、通常は見えない特徴を確認します。比較的複雑な光学系により、灰色の背景に白から黒に見える物体の画像が生成されます。この画像は、位相差顕微鏡法で得られる画像に似ていますが、明るい回折ハローがありません。この技術は、フランシス ヒューズ スミスによって発明されました。^{[1] [要出典]} 「スミス DIK」はドイツのエルンスト ライツ ウェッツラーによって製造されましたが、製造が困難でした。DIC は、1952 年にポーランドの物理学者ジョルジュ ノマルスキーによってさらに開発されました。^[2]

DIC は、偏光光源を 2 つの直交偏光の相互コヒーレントな部分に分離し、サンプル面で空間的に変位 (せん断) させて、観察前に再結合することによって機能します。再結合時の 2 つの部分の干渉は、光路差 (屈折率と幾何学的経路長の積) に敏感です。サンプル内の光路差がゼロのときの干渉を決定する調整可能なオフセット位相を追加すると、コントラストはせん断方向に沿った経路長勾配に比例し、サンプルの光学密度の変化に対応する 3 次元の物理的レリーフの外観が得られ、地形的に正確な画像は提供されませんが、線とエッジが強調されます。

1.非偏光が顕微鏡に入り、45° で偏光されます。

この技術が機能するには偏光が必要です。

2.偏光は最初のノマルスキー修正 ウォラストンプリズムに入り、互いに 90° 偏光した2 つの光線、サンプリング光線と参照光線に分離されます。

ウォラストン プリズムは、石英などの結晶質の 2 層で作られたプリズムの一種で、光の偏光に応じて屈折率が変化するため、偏光に応じて光を分割します。ノマルスキー プリズムでは、2 つの光線がプリズム本体の外側の焦点に集まり、プリズムをアクティブに焦点合わせできるため、顕微鏡のセットアップ時に柔軟性が高まります。

3. 2 本の光線はコンデンサーによって集束され、サンプルを通過します。この 2 本の光線は、サンプル内の約 0.2 μm 離れた 2 つの隣接する点を通過するように集束されます。

サンプルは、0° 偏光と 90° 偏光の 2 つのコヒーレント光源によって効果的に照射されます。ただし、これら 2 つの照明は完全には揃っておらず、一方が他方に対してわずかにずれています。

4.光線は、せん断によって分離されたサンプルの隣接領域を通過します。分離は通常、顕微鏡の解像度と同程度です。屈折率や厚さが異なる領域では、光線は異なる光路長を経験します。これにより、光学的に密度の高い材料で波が受ける遅延により、一方の光線の位相が他方の光線に対して変化します。

多数の光線対がサンプル内の隣接する点の対を通過すると (そしてサンプルによる吸収、屈折、散乱)、サンプルの画像が 0° と 90° の偏光の両方で運ばれることになります。これらを個別に見ると、サンプルの明視野画像となり、互いにわずかにずれています。光は、人間の目には見えない画像、つまり光の位相に関する情報も運んでいます。これは後で重要になります。異なる偏光により、この時点でこれら 2 つの画像が干渉するのを防ぎます。

5.光線は対物レンズを通過し、2 番目のノマルスキー修正ウォラストン プリズムに焦点を合わせます。

6. 2 番目のプリズムは2 つの光線を 135° の偏光に再結合します。光線の結合により干渉が起こり、光路差に応じてその時点で画像が明るくなったり暗くなったりします。

このプリズムは 2 つの明視野画像を重ね合わせ、それらの偏光を揃えて干渉できるようにします。ただし、照明のオフセットのため、画像が完全には揃いません。つまり、標本の同じ点を通過した 2 つの光線の間で干渉が発生するのではなく、隣接する点を通過した光線の間で干渉が発生し、わずかに位相が異なります。位相の違いは光路長の違いによるため、この光の再結合により光路長の「光学的差異」が発生し、表示される画像が生成されます。

画像は、非常に斜めの照明の下で 3 次元の物体のように見え、対応する面に強い光と暗い影が生じます。見かけの照明の方向は、ウォラストン プリズムの方向によって定義されます。

上で説明したように、画像は、わずかにずれた (通常約 0.2 μm) 2 つの同一の明視野画像を重ね合わせて生成され、位相差による干渉によって位相の変化 (つまり光路長の変化) が暗さの目に見える変化に変換されます。この干渉は建設的または破壊的であり、3 次元の特徴的な外観を生み出します。

干渉を引き起こす典型的な位相差は非常に小さく、90° (波長の 4 分の 1) を超えることはほとんどありません。これは、ほとんどのサンプルとそれらが含まれる媒体の屈折率が類似しているためです。たとえば、水中の細胞の屈折率の差は約 0.05 しかありません。この小さな位相差は、DIC が正しく機能するために重要です。2 つの物質間の接合部の位相差が大きすぎると、位相差が 180° (波長の半分) に達し、完全な破壊的干渉と異常な暗い領域が生じる可能性があるためです。位相差が 360° (波長全体) に達すると、完全な建設的干渉が生じ、異常な明るい領域が生じます。

画像は、（サンプルによる屈折と吸収、およびビーム分離の解像度の限界を無視して）せん断に沿ったサンプル全体の位置に対する光路長の微分、つまりサンプルの屈折率（光学密度）の微分として近似できます。

コントラストは、オフセット位相を使用して調整できます。オフセット位相は、対物レンズのノマルスキー プリズムを移動するか、偏光子とコンデンサー ノマルスキー プリズムの間にラムダ/4 波長板を配置することで調整できます (デセナルモン補正)。結果として得られるコントラストは、ゼロ位相オフセットの暗視野 (強度はせん断差の 2 乗に比例) から、位相が約 5 ～ 90 度の場合に見られる典型的なレリーフ、そして 360 度の光学染色 (位相差に応じて消光波長がシフト) まで変化します。

連続的にシフトされた画像を照合すると、物体によって導入された位相シフトを、望ましくない非干渉アーティファクトから切り離すことができ、特に濁ったサンプルではコントラストが改善されることが多い。^[3]

DICは、組織培養からの塗抹標本や個々の水系単細胞生物など、生きた未染色の生物学的サンプルを画像化するために使用されます。最大限に空間的に非干渉性の照明により、理論上の解像度はエワルド球によって決定される理論上の最大カバレッジに近づきます。^{[4]これは、}位相コントラストなどのより高いコヒーレンス度を必要とする方法の改良です。

DIC が使用される非生物学的分野の 1 つは、平面シリコン半導体処理の分析です。シリコン処理における薄い (通常 100～1000 nm) フィルムは、多くの場合、可視光に対してほぼ透明であり (例: 二酸化シリコン、窒化シリコン、多結晶シリコン)、フィルム内の欠陥やフィルム上の汚染物質がより目立ちます。これにより、特徴が基板材料の穴なのか、または上にある異物のかたまりなのかを判断することもできます。エッチングされた結晶の特徴は、DIC で特に目立つ外観になります。

適切な条件下で使用した場合、画像品質は解像度において優れています^{[引用が必要]}。ただし、DIC 画像の分析では、ウォラストン プリズムの方向と見かけの照明方向を常に考慮する必要があります。これに平行な特徴は表示されないためです。ただし、サンプルを回転させて画像の変化を観察するだけで、この問題は簡単に克服できます。

• 古典的な干渉顕微鏡
• ナノビッド顕微鏡

• Murphy, D.、「微分干渉コントラスト (DIC) 顕微鏡法と変調コントラスト顕微鏡法」、光学顕微鏡法とデジタルイメージングの基礎、Wiley-Liss、ニューヨーク、pp. 153–168 (2001)。
• Salmon, E. および Tran, P.、「高解像度ビデオ強化微分干渉コントラスト (VE-DIC) 光学顕微鏡」、Video Microscopy、Sluder, G. および Wolf, D. (編)、Academic Press、ニューヨーク、pp. 153–184 (1998)。
• 微分干渉コントラスト — 参考文献

• 微分干渉コントラストプライマー
• 微分干渉コントラスト 2020-07-25ウェイバックマシンにアーカイブ
• 反射光DIC顕微鏡
• 微分干渉コントラスト（DIC）ガイド