アラニンスキャン

分子生物学において、アラニンスキャンは、特定の残基が特定のタンパク質の安定性や機能にどのように寄与しているかを決定するために用いられる部位特異的変異誘発技術である。 ^{[ 1 ]}アラニンは、かさばらず化学的に不活性なメチル官能基を持ちながらも、他の多くのアミノ酸が持つ二次構造の好みを模倣するため、用いられる。変異した残基のサイズを維持する必要がある場合は、バリンやロイシンなどのかさばるアミノ酸が用いられることもある。

この手法は、特定の残基の側鎖が生物活性に重要な役割を果たしているかどうかを判断するためにも使用できます。これは通常、部位特異的変異導入法、または PCR ライブラリーを作成することによるランダムな方法で行われます。さらに、理論的なアラニン置換に基づいて熱力学的パラメータを推定する計算手法も開発されています。

この技術は、多くの側鎖が同時に分析され、タンパク質の精製や生物物理学的分析の必要性が回避されるため、迅速です。^{[ 2 ]}この技術は現時点で非常に成熟しており、生化学分野で広く使用されています。データは、 IR、NMR分光法、数学的手法、バイオアッセイなどでテストできます。^{[ 3 ]}^{[ 4 ]}^{[ 5 ]}

アラニンスキャン法の良い例の1つは、タンパク質の表面にある荷電残基の役割を調べることです。^{[ 6 ]}上皮ナトリウムチャネル（ ENaC ）の表面にある保存された荷電残基の役割に関する体系的な研究では、アラニンスキャン法を用いて、タンパク質を細胞表面に輸送する過程における荷電残基の重要性が明らかになりました。^{[ 6 ]}

アプリケーション

アラニンスキャン法を用いて、ヒト成長ホルモンとその受容体の細胞外ドメインとの界面に埋もれた19個の側鎖の機能的寄与を同時に決定した。^{[ 2 ]}側鎖の各アミノ酸をアラニンに置換した。次に、アラニンスキャン変異誘発と二項変異誘発の概念をファージディスプレイ技術と組み合わせたショットガンスキャン法を用いた。

アラニンスキャン法のもう1つの重要な応用は、プロトタイプシクロチドであるカラタB1の構造と活性に対する個々の残基の影響を決定することです。^{[ 3 ]}シクロチドは、医薬品として重要な幅広い生物活性を示しますが、その自然な機能は殺虫剤としての植物防御です。シクロチドカラタB1の構造では、23個の非システイン残基すべてがアラニンに順次置換されました。データはNMR分光法によってテストされました。

さらに、アラニンスキャン法は、Cry4Aa のどの機能モチーフが蚊殺滅活性を持つかを決定するためにも使用されます。^{[ 4 ]} Cry4Aa はBacillus thuringiensisによって産生されます。双翅目特異的毒素であり、蚊を制御するための生物殺虫剤の生産において重要な役割を果たします。したがって、Cry4Aa のどの機能モチーフがこの活性に寄与しているかを決定することは非常に重要です。この研究では、ドメイン II の潜在的な受容体結合部位、ループ 1、2、および 3 の残基をアラニンに置換することにより、いくつかの Cry4Aa 変異体が作製されました。活性をテストするために、 Culex pipiens を用いた生物検定が行われました。

アラニンワールドモデル

アラニンスキャン法は、ほとんどの標準アミノ酸を点突然変異によってアラニンに置換できるという事実を利用している。アラニンは、コードされている標準アミノ酸の大部分の二次構造特性を模倣するため、変異したタンパク質の二次構造はそのまま維持される。これは、アラニンワールドモデルによって予測されている。

参考文献

↑ Morrison KL、Weiss GA (2001年6月)。「組み合わせアラニンスキャン」。Curr Opin Chem Biol . 5 (3): 302–7 . doi : 10.1016/S1367-5931(00)00206-4 . PMID 11479122 .
1 2 Weiss GA、Watanabe CK、Zhong A、Goddard A、Sidhu SS (2000 年 8 月)。「組み合わせアラニンスキャンによるタンパク質機能エピトープの迅速なマッピング」。Proc . Natl . Acad. Sci. USA。97 ( 16) : 8950–4。Bibcode : 2000PNAS ... 97.8950W。doi : 10.1073 / pnas.160252097。PMC 16802。PMID 10908667。
1 2 Simonsen SM、Sando L、Rosengren KJ、Wang CK、Colgrave ML、Daly NL、Craik DJ (2008 年 4 月)。「プロトタイプシクロチドのアラニンスキャニング変異誘発により、生物活性に必須な残基のクラスターが明らかになった」。J . Biol. Chem . 283 (15): 9805–13 . doi : 10.1074/jbc.M709303200 . PMID 18258598 .
1 2 Howlader MT、Kagawa Y、Miyakawa A、Yamamoto A、Taniguchi T、Hayakawa T、Sakai H (2010 年 2 月)。「バチルス・チューリンゲンシス蚊殺毒素 Cry4Aa のドメイン II の 3 つの主要ループのアラニンスキャン解析」。Appl . Environ. Microbiol . 76 (3 ) : 860–5。Bibcode : 2010ApEnM..76..860H。doi : 10.1128 / AEM.02175-09。PMC 2813026。PMID 19948851。
↑ Gauguin L、Delaine C、Alvino CL、McNeil KA、Wallace JC、Forbes BE、De Meyts P (2008年7月)。「インスリン様成長因子-Iの推定受容体結合表面のアラニンスキャン」。J . Biol. Chem . 283 (30): 20821–9 . doi : 10.1074/jbc.M802620200 . PMC 3258947. PMID 18502759 .
1 2 Edelheit O、Hanukoglu I、Dascal N、Hanukoglu A (2011 年 4 月)。「アラニン変異誘発による上皮ナトリウムチャネル (ENaC) サブユニットの細胞外ドメインにおける保存された荷電残基の役割の特定」。Am . J. Physiol. Renal Physiol . 300 (4): F887–97. doi : 10.1152/ajprenal.00648.2010 . PMID 21209000 . S2CID 869654 .

さらに読む

ミシェルズ CA (2002).生物学的研究のための遺伝子技術：ケーススタディによるアプローチ. ロンドン：J. ワイリー. p. 111. ISBN 978-0-471-89921-1。

[pmid11479122-1] Morrison KL、Weiss GA (2001年6月)。「組み合わせアラニンスキャン」。Curr Opin Chem Biol . 5 (3): 302–7 . doi : 10.1016/S1367-5931(00)00206-4 . PMID 11479122 .

[Weiss_2000-2] 1 2 Weiss GA、Watanabe CK、Zhong A、Goddard A、Sidhu SS (2000 年 8 月)。「組み合わせアラニンスキャンによるタンパク質機能エピトープの迅速なマッピング」。Proc . Natl . Acad. Sci. USA。97 ( 16) : 8950–4。Bibcode : 2000PNAS ... 97.8950W。doi : 10.1073 / pnas.160252097。PMC 16802。PMID 10908667。

[Simonsen_2008-3] 1 2 Simonsen SM、Sando L、Rosengren KJ、Wang CK、Colgrave ML、Daly NL、Craik DJ (2008 年 4 月)。「プロトタイプシクロチドのアラニンスキャニング変異誘発により、生物活性に必須な残基のクラスターが明らかになった」。J . Biol. Chem . 283 (15): 9805–13 . doi : 10.1074/jbc.M709303200 . PMID 18258598 .

[Howlader_2010-4] 1 2 Howlader MT、Kagawa Y、Miyakawa A、Yamamoto A、Taniguchi T、Hayakawa T、Sakai H (2010 年 2 月)。「バチルス・チューリンゲンシス蚊殺毒素 Cry4Aa のドメイン II の 3 つの主要ループのアラニンスキャン解析」。Appl . Environ. Microbiol . 76 (3 ) : 860–5。Bibcode : 2010ApEnM..76..860H。doi : 10.1128 / AEM.02175-09。PMC 2813026。PMID 19948851。

[pmid18502759-5] Gauguin L、Delaine C、Alvino CL、McNeil KA、Wallace JC、Forbes BE、De Meyts P (2008年7月)。「インスリン様成長因子-Iの推定受容体結合表面のアラニンスキャン」。J . Biol. Chem . 283 (30): 20821–9 . doi : 10.1074/jbc.M802620200 . PMC 3258947. PMID 18502759 .

[pmid21209000-6] 1 2 Edelheit O、Hanukoglu I、Dascal N、Hanukoglu A (2011 年 4 月)。「アラニン変異誘発による上皮ナトリウムチャネル (ENaC) サブユニットの細胞外ドメインにおける保存された荷電残基の役割の特定」。Am . J. Physiol. Renal Physiol . 300 (4): F887–97. doi : 10.1152/ajprenal.00648.2010 . PMID 21209000 . S2CID 869654 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]