サスペンションアレイ技術

サスペンションアレイ技術（またはSAT ）は、分子生物学で使用される高スループット、大規模、マルチプレックススクリーニングプラットフォームです。SA​​Tは、一塩基多型（SNP）ジェノタイピング、遺伝性疾患スクリーニング、遺伝子発現プロファイリング、スクリーニング薬物発見、臨床診断などのゲノムおよびプロテオーム研究に広く適用されています。 ^{[1] [2] [3]} SATは、マイクロスフェアビーズ（直径5.6μm）を使用してアレイを準備します。SATでは、各タイプのマイクロスフェアビーズが光学特性（最も一般的なのは蛍光色）の変化に基づいて一意に識別されるため、これらのマイクロスフェアビーズを使用して複数の遺伝子変異を同時にテストできます。各色と色の強度には固有の波長があるため、ビーズは波長強度に基づいて簡単に区別できます。マイクロスフェアは溶液中に容易に懸濁でき、アッセイ中に好ましい動態を示します。フラットマイクロアレイ（例：DNAマイクロアレイ）と同様に、DNAオリゴヌクレオチドプローブ、抗体、またはその他のタンパク質などの適切な受容体分子が、異なるラベルが付けられたマイクロスフィアに付着します。これにより、数千のマイクロスフィアアレイ要素が生成されます。プローブ-ターゲットハイブリダイゼーションは通常、光学的にラベル付けされたターゲットによって検出され、サンプル中の各ターゲットの相対的な存在量が決定されます。^[4]

DNA は、テスト フラグメントを作成するために使用される細胞から抽出されます。これらのテスト フラグメントは、さまざまなマイクロスフィア ビーズを含む溶液に追加されます。各タイプのマイクロスフィア ビーズには、固有の蛍光ID を持つ既知の DNA プローブが含まれています。テスト フラグメントとマイクロスフィア ビーズ上のプローブは、互いにハイブリダイズできます。ハイブリダイズすると、マイクロスフィア ビーズは通常、フローサイトメトリーを使用して分類されます。これにより、元のサンプルから各遺伝子変異を検出できます。収集された結果データは、マイクロスフィアに対する各ハイブリダイズ サンプルの相対的な存在量を示します。

マイクロスフィアビーズは溶液中に容易に懸濁され、各マイクロスフィアは試験サンプルとハイブリダイズされてもその同一性を保持するため、典型的なサスペンションアレイ実験では、1 回の反応で幅広い生物学的分析を分析できます。これは「マルチプレキシング」と呼ばれます。一般に、アレイで使用される各タイプのマイクロスフィアは、個別にバルクで準備されます。たとえば、Luminex xMAP テクノロジーの市販のマイクロスフィアアレイでは、10X10 要素アレイが使用されます。このアレイには、それぞれ 10 の異なる強度を持つ赤色および赤外線染料を含むビーズが含まれ、100 要素のアレイになります。^[4]したがって、複数の染料を使用すると、アレイのサイズは指数関数的に増加します。たとえば、染料ごとに 10 の異なる強度を持つ 5 つの異なる染料は、100,000 の異なるアレイ要素を生み出します。

異なるタイプのマイクロスフィアを使用する場合、SATは、特定のサンプル内のDNAやタンパク質などの複数の変数を同時にテストできます。これにより、SATは単一の反応でさまざまな分子ターゲットを分析できます。一般的な核酸検出方法には、直接DNAハイブリダイゼーションが含まれます。直接DNAハイブリダイゼーションアプローチは、マイクロスフィアに結合した15〜20 bpのDNAオリゴヌクレオチドをPCRを使用して増幅する最も単純なサスペンションアレイアッセイです。これは、プローブターゲットハイブリダイゼーション中に異なるプローブ間の融点の変動を最小限に抑えるため、最適化されたプローブ長です。^[1]対象のDNAオリゴプローブを1つ増幅した後、それを使用して、100の異なるマイクロスフィアセット上に100の異なるプローブを作成できます。各プローブは、100プレックスアレイを使用する場合、100個の潜在的なターゲットを捕捉できます。同様に、ターゲットDNAサンプルは通常、PCR増幅およびラベル付けされます。^[4]捕捉プローブと標的DNAのハイブリダイゼーションは、相補的な標的DNA配列をマイクロスフィア上に配置された捕捉プローブに融解およびアニーリングさせることによって達成される。配列間の非特異的結合を除去するために洗浄した後、強く対になったプローブ標的のみがハイブリダイズしたままとなる。^[1]

このトピックの詳細については、フローサイトメトリーを参照してください。

各マイクロスフィアの光学的な同一性は既知であるため、フローサイトメトリーを使用して、マイクロスフィアの 1 セット内のターゲット マーカーの相対的な強度を別のマイクロスフィアのセット内のターゲット マーカーと比較することで、マイクロスフィアにハイブリダイズしたターゲット サンプルの定量化を実現できます。マイクロスフィアは、固有の光学特性とターゲット シーケンスへのハイブリダイゼーション レベルの両方に基づいて分類できます。

• 高速/高スループット：マルチプレックス分析では、100プレックスアッセイを30秒ごとに分析できます。最近報告された高スループットフローサイトメトリーは、96ウェルプレートを1分でサンプリングでき、理論的には、このシステムを使用した100プレックスアッセイは1秒未満で分析でき、1日あたり1,200万サンプルを処理できる可能性があります。^[4]
• 高密度アレイ/マルチプレックス:フラットなマイクロアレイと比較して、SAT では並列測定が可能です。数マイクロリットルのマイクロスフィアには数千のアレイ要素が含まれ、各アレイ要素は数百の個別のマイクロスフィアで表されます。したがって、フローサイトメトリーによる測定は、各アレイ要素の反復分析を表します。^[4]
• 効果的な情報収集： SATを使用する利点の1つは、患者または研究用生物から1つのサンプルを採取し、同時に複数の遺伝子変異を検査できることです。したがって、1つのサンプルから、患者が一連のウイルスのうちどのウイルスに感染しているか、または固有の表現型を持つ生物に存在する塩基対の変異を​​特定できます。^[3]
• コスト効率：現在、市販のサスペンションアレイキットのコストは、テストするシーケンスごとに0.10～0.25ドルです。^[1]

• アレイサイズが比較的小さい：より多くの染料を使用して何百万もの異なるアレイ要素を生成する可能性はありますが、現在市販されているマイクロスフェアアレイ（Luminex xMAPテクノロジー製）では2セットの染料しか使用していないため、実験ごとに約100個のターゲットしか検出できません。^[4]
• 異なるプローブセットとターゲット配列間のハイブリダイゼーションには、特定のアニーリング温度が必要であり、これはオリゴヌクレオチドプローブの長さと配列によって影響を受けます。したがって、すべての実験で使用できるアニーリング温度は 1 つだけです。したがって、特定の実験で使用されるすべてのプローブは、同じ温度でターゲットにハイブリダイズするように設計する必要があります。一部のプローブセットに塩基対の不一致を導入すると、各プローブセット間のアニーリング温度の差を最小限に抑えることができますが、1 つの反応で 10 ～ 20 を超えるターゲットをテストする場合、ハイブリダイゼーションの問題は依然として重大です。^[1]

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