表面プラズモン共鳴顕微鏡

表面プラズモン共鳴顕微鏡法（SPRM）は、表面プラズモン共鳴イメージング（SPRI）とも呼ばれ、^{[1]金属表面の}表面プラズモン共鳴と金属表面のイメージングを組み合わせたラベルフリーの分析ツールです。 ^{[2]金属表面の}屈折率 の不均一性により、共鳴角のシフトによって高コントラストの画像が得られます。^[1] SPRM は、サブナノメートルの厚さ感度を実現でき^[3]、横方向の分解能はマイクロメートルスケールの値を実現します。^{[4] SPRM は、}自己組織化単分子膜、多層膜、金属ナノ粒子、オリゴヌクレオチドアレイ、結合および還元反応などの表面の特性評価に使用されます。 ^{[5] [6] [7] [8] [9]} 表面プラズモンポラリトンは、金属表面の振動する自由電子と結合した表面電磁波で、金属/誘電体界面に沿って伝播します。^[10]ポラリトンは金属材料の屈折率の小さな変化に非常に敏感であるため、^[11]ラベル付けを必要としないバイオセンシングツールとして使用できます。 SPRM測定はリアルタイムで行うことができます。^[12]単一細胞内の膜タンパク質の結合速度の測定、 ^[13]またはDNAハイブリダイゼーションなど。 ^{[14] [15]}

古典的なSPRの概念は1968年から存在していましたが、SPRイメージング技術は1988年にRothenhäuslerとKnollによって導入されました。^[16]光学測定技術のために低コントラストのサンプルの高解像度画像をキャプチャすることは、1988年に登場したSPRM技術の導入までほぼ不可能な作業でした。SPRM技術では、プラズモン表面ポラリトン（PSP）波が照明に使用されます。簡単に言えば、SPRI技術は古典的なSPR分析の高度なバージョンであり、サンプルはCCDカメラを使用してラベルなしで監視されます。CCDカメラの助けを借りたSPRI技術は、センサーグラムとSPR画像を記録できるという利点があり、同時に何百もの相互作用を分析します。^[17]

表面プラズモンまたは表面プラズモンポラリトンは、金属中の自由電子と電界の結合によって生成される。^{[18] [19]} SPR波は、誘電体と自由電子が豊富な導電層との界面に沿って伝播する。^[20]

図2に示すように、光が高屈折率の媒体から屈折率の低い第2の媒体に通過する場合、特定の条件下では光は全反射されます。^[21]

全反射（TIR）を得るには、θ ₁と θ _{2 が}スネルの法則で説明できる特定の範囲内にある必要があります。光が高屈折率媒体を通過して低屈折率媒体に入ると、式 1 で定義される角度 θ _{2で反射されます。} ^{[引用が必要]}

_{TIRプロセスでは、}反射光の一部が電界強度のわずかな部分を媒体2に漏らします（_η1 > η2 ）。媒体2に漏らした光はエバネッセント波として浸透します。エバネッセント波の強度と浸透深度は、それぞれ式2と式3に従って計算できます。^[22]

図3は、表面プラズモンが電子密度振動と結合した模式図です。光波は金属表面の電子との集合的結合により金属層の表面に閉じ込められます。電子のプラズマと光波の電界が周波数振動を結合すると、共鳴状態になります。^{[23] [24]}

最近、金属表面内部の漏れ光が画像化されました。^[25] 異なる波長（緑、赤、青）の放射は、金属/誘電体界面での光子の相互作用を通じて表面プラズモンポラリトンに変換されました。2つの異なる金属表面、金と銀を使用しました。各金属と光子の波長におけるxy平面（金属平面）に沿ったSPPの伝搬距離を比較しました。伝搬距離は、式4で定義されているように、強度が1/eの係数で減少する前に金属に沿ってSPPが移動する距離として定義されます。^{[引用が必要]}

図 4 は、金 (a) と銀 (b) のフィルム内の緑、赤、青の光子の漏洩光をカラー CCD カメラで撮影した様子を示しています。図 4 の c) の部分には、距離による表面プラズモンポラリトンの強度が示されています。漏洩光の強度は導波路内の強度に比例することがわかりました。^{[引用が必要]}

ここでδSPP_は伝搬長、ε'mとε''mは金属の比誘電率、λ0は自由空間波長である。^[26]

金属膜は、電磁場との相互作用によって引き起こされる伝導帯電子のコヒーレント振動により、光を吸収することができます。^[27] 伝導帯の電子は、放射線の電場との相互作用後に分極を誘導します。金属膜の表面で正味の電荷差が生成され、同じ位相を持つ電子の集合的な双極子振動が生成されます。^[28] 電子の動きが電磁場の周波数と一致すると、入射光の吸収が発生します。金の表面プラズモンの振動周波数は、電磁スペクトルの可視領域にあり、赤色になり、銀は黄色になります。^[29] ナノロッドは、縦方向と横方向の振動により、UV-vis領域で2つの吸収ピークを示します。金ナノロッドの場合、横方向の振動は520 nmでピークを生成し、縦方向の振動は600〜800 nmの範囲内のより長い波長で吸収を生成します。^{[29] [30]} 銀ナノ粒子は光吸収波長をより高いエネルギーレベルにシフトさせ、球形から棒状、ワイヤ状に変化すると、それぞれ408nmから380nm、372nmに青色シフトします。^[31] 金と銀の吸収強度と波長は、粒子の大きさと形状によって異なります。^[32]

図5では、銀ナノ粒子のサイズと形状が散乱光の強度と銀ナノ粒子の最大波長に影響を与えています。三角形の粒子は最大散乱光が670～680 nmで赤く表示され、五角形の粒子は緑色（620～630 nm）で表示され、球形粒子は吸収エネルギーが高く（440～450 nm）、青色で表示されます。^[33]

表面プラズモンポラリトンは、金属の伝導帯の自由電子と結合した電磁波によって構成される準粒子である。^[34] p偏光を金属-誘電体界面と結合するために広く使用されている方法の1つは、プリズムベースの結合である。^[35] プリズムカップラーは、表面プラズモンポラリトンを励起するために最も広く使用されている。この方法は、TIRが金属表面の自由電子を結合するエバネッセント波を生成する、クレッチマン-ラーテル構成とも呼ばれる。^[36] 高開口数対物レンズは、表面プラズモンポラリトンを励起するためのプリズム結合の変形として研究されてきた。^[15]導波路結合も表面プラズモンを生成するために使用される。

クレッチマン・レーサー構成は、光と金属表面の自由電子との共鳴を実現するために使用されます。この構成では、高屈折率のプリズムが金属フィルムと接合されています。光源からの光はプリズムを通って伝播し、金属フィルムに入射します。TIRの結果として、一部は金属フィルムから漏れ、図6に示すように誘電体媒体にエバネッセント波を形成します。^[12] エバネッセント波は、光学的に密度の低い媒体に特徴的な距離浸透し、そこで減衰します。^[37]

_{図6は、屈折率}η1のプリズムが屈折率η2の誘電体表面に結合され、_光の入射角がθであるクレッチマン・ラーテル構成を示しています。

TIRにおける光と表面ポラリトンの相互作用はフレネル多層反射を用いて説明することができ、振幅反射係数（rpmd）は式5のように表される。_[ ^38]

電力反射係数R は次のように定義されます。

図 7 に、オットー プリズム結合プリズムの概略図を示します。図 7 では、概略図を説明するために空気ギャップが少し厚く示されていますが、実際にはプリズムと金属層の間の空気ギャップは非常に薄いです。

電磁波は光導波路を通って伝導される。光が薄い金属層のある領域に入ると、光は金属層をエバネッセント透過し、表面プラズモン波（SPW）を励起する。導波路結合構成では、格子の屈折率が基板の屈折率よりも大きいときに導波路が形成される。入射光は高屈折率の導波層に沿って伝播する。^[39] 図8では、電磁波は導波層を通って導かれ、光波が導波層金属界面に到達すると、エバネッセント波が発生する。エバネッセント波は金属-誘電体界面で表面プラズモンを励起する。^[40]

周期格子により、入射光と導波モード間の位相整合が容易になる。^[41] 式7によれば、周期性Λを変更することで、 z方向の伝搬ベクトル（ Kz）を調整できる。格子ベクトルを変更して、共鳴励起の角度を制御することができる。^[42] 図9で、qは回折次数であり、任意の整数（正、負、またはゼロ）の値を取ることができる。^[43]

表面と平行な単色光線の伝播定数は式8で定義される。^[44]

ここでθは入射角、k _spは表面プラズモンの伝搬定数、n _{( p )は}プリズムの屈折率である。SPWの波数ベクトルk _spが入射光の波数ベクトルと一致する場合、SPWは次のように表される。^[44]${\textstyle k_{x}}$

ここでεdとεmは誘電体と金属の誘電率を表し、入射光の波長は λに対応する。kx とkspは次のように表される。^[44]

表面プラズモンはエバネッセント波であり、その強度は界面で最大となり、界面から浸透深度まで指数関数的に減衰する。^[13] 表面プラズモンの伝播は、導電層上の薄膜コーティングによって強く影響を受ける。金属表面が誘電体でコーティングされている場合、表面プラズモンの伝播ベクトルkの変化により、共鳴角θがシフトする。 ^[45] この感度は、エバネッセント波の浸透深度が浅いためである。自由電子の量が多い材料が使用される。銅、チタン、クロム、金でできた約50 nmの金属膜が使用される。ただし、SPRでもSPRMでも、Auが最も一般的に使用される金属である。

走査角SPRは、生体分子の相互作用を検出するために最も広く使用されている方法です。^[40] これは、固定励起波長での入射角の関数として、プリズム/金属フィルムアセンブリからの反射率（%R）を測定します。入射角がインターフェースの伝播定数と一致すると、このモードは反射光の消費時に励起されます。その結果、共鳴角での反射率の値がダンプされます。^[46]

ポラリトンの伝搬定数は、誘電体材料を変えることによって変更できます。この変更により、表面プラズモン伝搬定数の変化により 、図 10 に示す例のように共鳴角がθ _1からθ ₂にシフトします。

共鳴角は式11を使って求めることができます。

ここでn ₁、n ₂、n _{g は}それぞれ媒質1、2、金属層の屈折率である。^[46]

TIR 2次元イメージングを使用すると、固定角度 θでの %R の空間的な差を実現できます。単色光のビームを使用して、サンプルを一定の入射角で照射します。CCDカメラで検出された反射光からSPR画像が作成されます。^[13] 共鳴角での %R の最小値がSPRMを提供します。^[8]

黄と共同研究者は、高開口数（NA）対物レンズを備えた顕微鏡を開発し、縦方向の解像度を犠牲にして横方向の解像度を向上させた。^[47]

従来の光学顕微鏡の解像度は、光の回折限界によって制限されます。SPRM では、励起された表面プラズモンは入射ビーム光から水平方向に配置されます。ポラリトンは、金属と誘電体の界面に沿って、一定時間移動し、光子に戻ります。したがって、SPRM によって達成される解像度は、入射面に平行な表面プラズモンの伝搬長 ksp によって決まります。^[46] 2 つの領域間の分離は、分解するためには、おおよそ ksp の大きさである必要があります。Berger、Kooyman、および Greve は、励起波長を変更することで横方向の解像度を調整できることを示しました。励起エネルギーが増加すると、より良い解像度が得られます。式 4 および 12 は、表面プラズモンの波数ベクトルの大きさを定義します。^[48]

ここでn2_は媒質2の屈折率、ng_は金属膜の屈折率、λは励起波長である。^[46]

表面プラズモン共鳴顕微鏡法は、表面プラズモン共鳴と、CCDカメラを備えた機器を使用して基板上に存在する構造の所望の画像を記録することに基づいています。過去10年間で、SPRセンシングは非常に強力な技術であることが実証され、材料、生化学、薬学の研究開発でかなり広範囲に使用されています。^[49]

SPRM 装置は、以下の主要コンポーネントの組み合わせで動作します。光源光 (通常は He-Ne レーザー) は、ガラス側に取り付けられたプリズムを通過します。プリズムは金属薄膜 (通常は金または銀) でコーティングされており、金と溶液の界面で光線が臨界角よりも大きな角度で反射します。^[1]界面表面からの反射光は CCD 検出器によって記録され、画像が記録されます。上記のコンポーネントは SPRM にとって重要ですが、偏光子、フィルター、ビーム エキスパンダー、集束レンズ、回転ステージなど、いくつかのイメージング方法に類似した追加のアクセサリが、アプリケーションで要求される効果的な顕微鏡技術のために装置にインストールされ、使用されます。図 12 は、一般的な SPRM を示しています。アプリケーションに応じて、またイメージング技術を最適化するために、研究者はこの基本的な装置に設計変更をいくつか加え、光源ビームの変更も含めます。異なる SPRM をもたらしたこのような設計変更の 1 つは、図 11 に示すように、光学構成にいくつかの変更を加えた対物レンズ型です。^[47]

SPRiシステムは現在、GEライフサイエンス、HORIBA、Biosensing USAなどの有名なバイオメディカル機器メーカーによって製造されています。SPRiのレンジャーのコストは10万～25万ドルですが、簡単なデモ用プロトタイプは2000ドルで作ることができます。^[50]

SPRMの測定を行うには、サンプルの準備が重要なステップです。固定化ステップによって影響を受ける要因は2つあります。1つは取得データの信頼性と再現性です。実験条件下では、抗体、タンパク質、酵素などの認識要素の安定性を確保することが重要です。さらに、固定化された標本の安定性は、感度や検出限界（LOD）に影響を与えます。^{[51] [52]}

最もよく使用される固定化方法の 1 つは、金表面への自己組織化単分子膜 (SAM) です。Jenkins と共同研究者 2001 は、オクタデカンチオール (ODT) で構成された SAM で囲まれたメルカプトエタノール パッチを使用して、ODT SAM への卵ホスファチジルコリンの吸着を研究しました。^[5] ODT メルカプトエタノールのパターンは、50 nm の金フィルム上に作成されました。金フィルムは、LaSFN 9 ガラス上での熱蒸発によって得られました。脂質小胞は吸着によって ODT SAM 上に堆積され、最終的な多層の厚さは 80 Å を超えました。^{[引用が必要]}

11-メルカプトウンデカン酸自己組織化単分子膜（MUA-SAM）を金コーティングしたBK7スライド上に形成した。PDMSプレートをMUA-SAMチップ上にマスクした。クレンブテロール（CLEN）は、BSAのカルボキシル基とCLEN分子のアミン基の間のアミド結合を介してBSA分子に付着した。金表面にBSAを固定化するために、PDMS作製によって作成されたスポットをスルホ-NHSおよびEDCで機能化し、続いて1％BSA溶液をスポットに注ぎ、1時間インキュベートした。固定化されていないBSAをPBSで洗い流し、CLEN溶液をスポットに注ぎ、固定化されていないCLENをPBS洗浄によって除去した。^[53]

アルカンチオールSAMは、SPRを介してホースラディッシュペルオキシダーゼ（Px）、ヒト免疫グロブリンE（IgE）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）、およびヒト免疫グロブリンG（IgG）の濃度を同時に測定するために調製されました。11個と16個の炭素からなる炭素鎖で作られたアルカンチオールは、センサーチップ上で自己組織化されました。抗体は、末端カルボキシル基を持つC16アルカンチオールに付着しました。^[54]

マイクロパターン電極は、顕微鏡スライド上に金を堆積させることで作製されました。PDMS スタンピングを使用して親水性/疎水性表面の配列を作成しました。ODT 処理の後に 2-メルカプトエタノール溶液に浸漬することで、脂質膜堆積用の機能化された表面になりました。パターン電極は SPRM によって特性評価されました。図 14 B の SPRM 画像では、ポケットのサイズが 100 um x 100 um で、ポケット間の距離が 200 um であることが示されています。画像からわかるように、画像の顕著なコントラストは、この技術の高感度によるものです。^{[引用が必要]}

SPRMは、溶液中の生体分子の濃度を測定し、結合分子を検出し、分子相互作用をリアルタイムでモニタリングするための有用な技術です。これは、生体分子の表面相互作用（抗原抗体結合、マッピング、吸着速度論）のバイオセンサーとして使用できます。たとえば、小児の1型糖尿病の原因の1つとして、血清中にIgG、IgA、IgM（主にIgAによる）の高レベルな牛乳抗体が存在することが挙げられます。^[55] SPRMを使用すると、牛乳と血清のサンプルで牛乳抗体を検出できます。^[56] SPRMは、抗体アレイ上のリンパ球BまたはTの部位特異的付着を検出するのにも有利です。この技術は、表面上の細胞のラベルフリーでリアルタイムの相互作用を研究するのに便利です。そのため、SPRMは細胞表面接着速度論の診断ツールとして使用できます。^[57] ただし、そのメリットの他に、SPRMには制限があります。低分子量分子の検出には適用できません。ラベルフリーではあるが、非常にクリーンな実験条件が必要となる。SPRMの感度はMALDI-MSと組み合わせることで向上させることができる。^[58] SPRMには数多くの用途があり、そのうちのいくつかをここで説明する。

膜タンパク質は、細胞外シグナルに対する細胞応答の調節を担っています。膜タンパク質が疾患バイオマーカーや治療標的に関与していること、またそのリガンドとの結合速度を調査することは、これまで困難なことでした。従来のアプローチでは、膜タンパク質の明確な構造や機能を反映できませんでした。^[13] 膜タンパク質の構造の詳細を理解するためには、膜タンパク質を監視できる3次元および連続解像度を提供できる代替分析ツールが必要です。原子間力顕微鏡（AFM）は、膜タンパク質の高空間分解能画像を取得するのに最適な方法ですが、^[59] 結合速度を調査するには役に立たない可能性があります。蛍光顕微鏡（FLM）は、個々の細胞における膜タンパク質の相互作用を研究するために使用できますが、適切なラベルの開発が必要であり、さまざまなターゲットタンパク質に対する戦術が必要です。^[60] さらに、宿主タンパク質はラベル付けの影響を受ける可能性があります。^[61]

単一生細胞におけるMPの結合動態は、細胞膜からタンパク質を抽出せずにSPR顕微鏡に基づくラベルフリーイメージング法で研究することができ、科学者が膜タンパク質の実際の構造を研究するのに役立ちます。さらに、各細胞における膜タンパク質の分布と局所結合活性をマッピングして計算することができます。SPR顕微鏡（SPRM）は、同じサンプルの光学イメージングと蛍光イメージングを同時に可能にし、単一のセットアップでラベルベースとラベルフリーの検出方法の両方の利点を得られることを証明しています。^{[47] [62]}

SPRイメージングは​​、同じ実験条件下でアレイ形式で複数の吸着相互作用を研究するために使用されます。ネルソンと彼の同僚は、SPRイメージングで使用するために金表面上にDNAアレイを作成するための多段階の手順を導入しました。^[63] 親和性相互作用は、タンパク質や核酸などのさまざまな標的分子について研究できます。DNA配列の塩基の不一致は、大腸がんのリスクが高いリンチ症候群などの致命的な病気の数につながります。^[64]

SPRイメージングは​​、金表面からの反射率の変化によって可能になる金表面への分子の吸着をモニターするのに有用である。まずGGミスマッチペアは、金表面上の二本鎖DNAにヘアピン構造を形成する水素結合を介してリガンドであるナフチリジン二量体と結合することにより安定化される。二量体がDNAに結合すると、ハイブリダイゼーションの自由エネルギーが増大し、屈折率の変化を引き起こす。^[65]

ナフチリジン二量体の G-G ミスマッチ安定化特性をテストするために DNA アレイを作製しました。アレイ内の 4 つの固定化配列はそれぞれ 1 塩基ずつ異なっていました。この塩基の位置は、図 16 に示すように、配列 1 の X で示されています。SPR 差分画像は、配列 2 の相補配列である配列 1 の X 位置にシトシン (C) 塩基を持つ配列に対してのみ検出されました。しかし、ナフチリジン二量体の存在下での配列 2 の追加に対応する SPR 差分画像では、相補配列に加えて、配列 2 は G-G ミスマッチを形成する配列にもハイブリダイズすることが示されています。これらの結果は、SPR イメージングが単一塩基ミスマッチを監視し、ハイブリダイズした分子を選別するための有望なツールであることを示しています。^[65]

SPR イメージングは​​、抗体のタンパク質アレイへの結合を研究するために使用できます。^[66]タンパク質アレイの金表面上のアミン官能基は、抗体の結合を研究するために使用されます。タンパク質の固定化は、タンパク質溶液を PDMS マイクロチャネルに流すことによって行われました。次に、PDMS を表面から除去し、抗体溶液をアレイ上に流しました。図 17 は、カリウキと共同研究者によって得られた SPR 画像で、ヒトフィブリノーゲン、オボアルブミン、およびウシ IgG のタンパク質を含む 3 成分タンパク質アレイを示しています。アレイのこのコントラストは、抗体の局所結合の結果である屈折率の違いによるものです。これらの画像は、抗体の結合特異性が高く、アレイの背景への抗体の非特異的吸着がわずかであることを示しており、アレイの背景を変更することで改善できます。これらの結果に基づいて、SPR イメージング技術は、タンパク質アレイへの抗体の相互作用を研究するための診断ツールとして選択できます。^{[66] [67]}

タンパク質バイオマーカーの発見と検証は、疾患の診断に極めて重要です。SPRM と MALDI 質量分析計 (SUPRA-MS) を組み合わせることで、異なる質量に基づいて結合と分子特性の多重定量が可能になります。SUPRA-MS は、ヒト血漿に導入された潜在的な乳がんバイオマーカーである LAG3 タンパク質を検出、識別、および特性評価するために使用されます。ガラススライドをスパッタリングプロセスでクロムと金の薄層でコーティングして金チップを準備しました。金表面は、11-メルカプト-1-ウンデカノール (11-MUOH) と 16-メルカプト-1-ヘキサデカン酸 (16-MHA) の溶液を使用して機能化されました。この自己組織化単分子膜は、スルホ-NHS と EDC で活性化されました。16 個の液滴のパターンがマクロアレイ上に堆積されました。リンパ球活性化遺伝子 3 (α-LAG3) とラット血清アルブミン (α-RSA) に対して免疫グロビン G 抗体がスポットされました。バイオチップをSPRiに置き、フローセルで緩衝液を流した後、α-LAG3を注入した。付着したタンパク質には特別な画像ステーションを使用した。このステーションはMALDIにも設置できる。MALDIに設置する前に、捕捉したタンパク質を還元、消化し、汚染を避けるためにマトリックスにロードした。^[58]

抗原密度は反射率の変化ΔRに正比例する。これはエバネッセント波の浸透深さLzcが固定化抗原層の厚さよりも大きいためである。^[68]

ここで、は分子の屈折率増分であり、は感度プリズム、反射率です。 ${\displaystyle {\frac {\partial n}{\partial c}}}$${\displaystyle S_{PR}}$

LAG3タンパク質は、良好なトリプシン消化とマトリックス（α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸）の均質性により、きれいな質量スペクトルが得られました。LAG3タンパク質の比較的高い強度のm/zピークは1,422.70amuで見つかり、平均マスコットスコアは87.9±2.4でした。MS結果の検証は、MS-MS分析によってさらに確認されました。これらの結果は、ゲル内消化の古典的な分析方法と似ています。^[58]

S / N比が 10以上、信頼性が100%、チップ上でフェムトモルレベルでの検出が可能というこのカップリング技術の信頼性は証明されている。この技術を用いることで、タンパク質間相互作用やチップ上のペプチド分布を高い空間分解能で検出することができる。^[58]

アプタマーは、タンパク質などの生体分子を標的とする特定の DNA リガンドです。SPR イメージング プラットフォームは、アプタマーとタンパク質の相互作用を特徴付けるのに適しています。アプタマーとタンパク質の相互作用を研究するために、最初に、圧電ディスペンシング システムを使用して金基板上にチオール自己組織化単分子膜 (SAM) を形成することによりオリゴヌクレオチドがグラフトされます。チオール基は、N-ヒドロキシスクシンイミド (NHS) によって DNA ヌクレオチドに導入されます。59 番目の末端に第一級アミン基を持つターゲット オリゴヌクレオチドは、リン酸緩衝液 pH 8.0 で HS-C (11)-NHS に室温で 1 時間結合されます。^[要出典]アプタマー グラフト バイオセンサーは、すすいだ後、SPRM 上に配置します。次に、シグナル特異性のために、トロンビンを過剰のシトクロム C と共注入します。遊離トロンビンの濃度は、注入開始時の信号の初期勾配を濃度に対してプロットして得られる較正曲線によって決定されます。トロンビンとアプタマーの相互作用は、さまざまな濃度のトロンビンを注入している間、マイクロアレイ上でリアルタイムに監視できます。溶液相解離定数 KDsol (3.16 ± 1.16 nM) は、測定された遊離トロンビンの濃度から計算されます。^{[引用が必要]}

[THR---APT] = cTHR – [THR]、溶液中のアプタマーに結合したトロンビンの平衡濃度、[APT] = cAPT – [THR---APT]、溶液中の遊離アプタマーの濃度。

表面相解離定数 KDsurf (3.84 ± 0.68) は、平衡信号にラングミュア吸着等温線を当てはめることによって得られます。図 19 に示すように、KDsurf は表面グラフト密度に依存するため、両方の解離定数は大きく異なります。この依存性は、低シグマで溶液相親和性に直線的に外挿されます。^{[引用が必要]}

SPRi画像の違いは結合の存在と特異性に関する情報を提供しますが、複数の親和性部位がある場合の遊離タンパク質の定量には適していません。相互作用の速度論と親和性を調べるためにSPRMを使用することで、相互作用のリアルタイムモニタリングが可能になります。^[69]

生物学では表面プラズモン共鳴画像法 (SPRi) を 2 つの生体分子間の相互作用を特徴付けるために使用しますが、2 つのポリマー間の相互作用をモニターするのにも役立ちます。このアプローチでは、ホスト タンパク質 HP と呼ばれる 1 つのポリマーをバイオチップの表面に固定し、ゲスト ポリマー GP と呼ばれるもう 1 つのポリマーを SPRi バイオチップに挿入して相互作用を調べます。たとえば、アミン官能化ポリ (β-シクロデキストリン) のホスト タンパク質と PEG (ada)4 のゲスト タンパク質です。^{[引用が必要]}

SPRi バイオチップは、異なる濃度の HP の固定化に使用されました。チップ上に HP 活性部位のアレイが生成されました。HP の結合は、アミノ基を介して金表面の N-ヒドロキシスクシンイミド官能基に行われました。最初に SPRi システムにランニング バッファー溶液を充填し、次に SPRi バイオチップを分析チャンバーに配置しました。1 g/L と 0.1 g/L の異なる濃度の GP の 2 つの溶液をフロー セルに注入しました。両方のポリマーの会合と解離は、反射率の変化に基づいてリアルタイムで監視でき、SPRM からの画像は白いスポット (会合相) と黒いスポット (解離相) に基づいて区別できます。アダマンチル基のない PEG は、β-シクロデキストリンの空洞に吸着しませんでした。一方、HP のない GP はチップ上に吸着しませんでした。反応部位におけるSPRi応答の変化は、CCDカメラからの運動曲線とリアルタイム画像のキャプチャによって提供されます。光反射率の局所的な変化は、各ポイントのターゲット分子の量に直接関係しています。チップの表面の変化は、分子結合と運動プロセスに関する包括的な知識を提供します。^[70]

重要な生体材料の 1 つに、天然の骨材料に似ていることから骨再生の分野で非常に有用なポリマー ハイドロキシアパタイトがあります。ハイドロキシアパタイト (Ca10(PO4)6(OH)2) の利点は、骨組織内で石灰化によって形成され始め、骨結合の強化も促進することです。バイオミネラリゼーションは石灰化とも呼ばれ、カルシウム陽イオンは細胞と生理学的体液から発生し、リン酸陰イオンはリン酸エステルとリンタンパク質の加水分解と体液から生成されます。この現象は、in vitro 研究でもテストされています。^{[引用が必要]}

インビトロ研究では、アミノおよびカルボン酸の外部反応性シェルを備えたポリアミドアミン (PAMAM) デンドリマーがセンシング相として考えられています。これらのデンドリマーは、金表面に固定され、金表面に対して不活性である必要があります。したがって、デンドリマーを金表面に付着できるように、デンドリマーの末端にチオール基を導入する必要があります。カルボキシル基は、リン酸緩衝液中の N,N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩 (EDC) および N-ヒドロキシスクシンイミド (NHS) 溶液によって官能化されます。官能基 (アミド、アミノ、カルボキシル) は、試験液からカルシウムイオンを捕捉するイオンポンプとして機能します。次に、カルシウム陽イオンがリン酸陰イオンと結合して、デンドリマー表面にカルシウムリン酸ミネラル核を生成します。^[要出典]

SPRM は、鉱化の発生と速度に関する重要な定量的情報を提供できるほど感度が高いと期待されています。この鉱化の検出は、鉱物核の形成と成長によって引き起こされる特定の質量変化に基づいています。図 20 に示すように、核形成と鉱化の進行は SPRM によって監視できます。PAMAM を含むセンサーは SPRi 分析プラットフォームに固定され、図 21 に示すようにフローセル内の実験流体にさらされます。SPRM は質量変化の起源と性質を感知するようには適合されていませんが、鉱物の沈殿による屈折率の変化を検出します。^{[引用が必要]}