位相差顕微鏡

位相差顕微鏡

位相差顕微鏡
用途	染色されていない生物材料の顕微鏡観察
発明家	フリッツ・ゼルニケ
メーカー	ライカ、ツァイス、ニコン、オリンパスなど
モデル	キログラム
関連商品	微分干渉顕微鏡、ホフマン変調コントラスト顕微鏡、定量位相コントラスト顕微鏡

位相差顕微鏡法(PCM) は、透明な標本を通過する光の位相シフトを画像の明るさの変化に変換する光学顕微鏡法です。位相シフト自体は目に見えませんが、明るさの変化として表示されると目に見えるようになります。

光波が真空以外の媒体を通過すると、媒体との相互作用により、媒体の特性に応じて波の振幅と位相が変化します。振幅 (明るさ) の変化は光の散乱と吸収によって生じ、多くの場合は波長に依存し、色を生じさせることがあります。写真機器と人間の目は振幅の変化にのみ敏感です。そのため、特別な手配がなければ位相の変化は見えません。しかし、位相の変化は重要な情報を伝えることがよくあります。

位相差顕微鏡は生物学において特に重要である。図に示すように、明視野顕微鏡では見えない多くの細胞構造を明らかにすることができる。以前の顕微鏡学者は染色によってこれらの構造を可視化していたが、これには追加の準備と細胞の死が必要だった。位相差顕微鏡により、生物学者は生きた細胞を研究し、細胞分裂によって細胞がどのように増殖するかを研究することが可能になった。これは蛍光を使わずに細胞の構造と成分を定量化できる数少ない方法の1つである。^[1] 1930年代初頭に発明されて以来、^[2]位相差顕微鏡は顕微鏡法に大きな進歩をもたらしたことが証明され、発明者のフリッツ・ゼルニケは1953年にノーベル物理学賞を受賞した。 ^[3]この顕微鏡を製造した女性、キャロライン・ブリーカーはしばしば功績が認められない。

位相差顕微鏡で位相変化を可視化するための基本原理は、照明光（背景）と標本散乱光（前景の詳細を構成する光）を分離し、これらを別々に操作することです。

コンデンサー環を通過するリング状の照明光（緑）は、コンデンサーによって標本に焦点を合わせられます。照明光の一部は標本（黄色）によって散乱されます。残りの光は標本の影響を受けず、背景光（赤）を形成します。染色されていない生物標本を観察する場合、散乱光は弱く、背景光に対して通常は-90° 位相がずれています（標本の一般的な厚さと、生物組織と周囲の媒体の屈折率の差の両方による）。これにより、前景（青のベクトル）と背景（赤のベクトル）の強度がほぼ同じになり、画像コントラストが低下します。

位相差顕微鏡では、像のコントラストは2つの方法で高められます。1つは、標本を含む視野領域で散乱光線と背景光線の間に建設的干渉を発生させること、もう1つは、像面に到達する背景光の量を減らすことです。^[4]まず、背景光を位相シフトリングに通すことで、背景光は-90°位相シフトされ、背景と散乱光線の位相差がなくなります。

次に、光が像面（カメラまたは接眼レンズが配置されている場所）に焦点を合わせると、この位相シフトにより、サンプルを含む視野領域（つまり、前景）から発生する背景光線と散乱光線が建設的に干渉し、サンプルを含まない領域と比較してこれらの領域の明るさが増加します。最後に、背景はグレーのフィルターリングによって約 70～90% 暗くなります。この方法では、照明光によって生成される散乱光の量が最大化される一方で、像面に到達する照明光の量が最小化されます。フィルターの表面全体を照らす散乱光の一部は、リングによって位相シフトされ、暗くなりますが、位相シフトリングとグレーフィルターリングのみを照らす背景光よりもはるかに少ない程度です。

上記は負の位相コントラストについて説明しています。正の形式では、背景光は代わりに +90° 位相シフトされます。したがって、背景光は散乱光に対して 180° 位相がずれます。次に、散乱光が背景光から差し引かれ、最初の図に示すように、前景が暗く、背景が明るい画像が形成されます。^{[5] [6] [7]}

位相差顕微鏡の成功は、その後の位相画像化法の多くにつながった。1952年、ジョルジュ・ノマルスキーは、今日では微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡として知られるものの特許を取得した。^[8] これは、物体が側面から照らされているかのように人工的な影を作り出すことでコントラストを高める。しかし、DIC顕微鏡は、物体またはその容器が偏光を変える場合には適していない。細胞生物学において偏光プラスチック容器の使用が増えるにつれて、DIC顕微鏡は、1975年にロバート・ホフマンが発明したホフマン変調コントラスト顕微鏡にますます取って代わられつつある。 ^[9]

従来の位相コントラスト法は、明るさと位相情報を 1 つの画像に融合し、光学的にコントラストを高める。1990年代半ばにデジタル カメラが導入されて以来、いくつかの新しいデジタル位相イメージング法が開発されており、これらは総称して定量位相コントラスト顕微鏡法と呼ばれている。これらの方法では、通常の明視野画像といわゆる位相シフト画像の2 つの別々の画像をデジタルで作成する。各画像ポイントで、位相シフト画像は、物体によって引き起こされる定量化された位相シフトを表示し、これは物体の光学的な厚さに比例する。 ^[10]このように、関連する光学フィールドを測定すると、光学逆問題を解いて物体の散乱ポテンシャルを計算的に再構築することで、従来の位相コントラストに関連するハロー アーティファクトを改善できる。^[11]

• 生細胞イメージング
• 位相コントラスト画像
• 位相コントラストX線画像

ウィキメディア・コモンズには、位相差顕微鏡に関連するメディアがあります。

• 光学顕微鏡入門 - フロリダ州立大学による位相差顕微鏡法
• 位相差顕微鏡と暗視野顕微鏡（パリ南大学）
• 顕微鏡部品について知っておくべきこと。