電気化学アプタマーベースのバイオセンサー

アプタマーは一本鎖RNAおよびDNA配列であり、分析対象物に結合してその構造を変化させます。これらは、タンパク質、細菌細胞、金属イオンなどの分子に選択的に結合する核酸として機能します。^[1]アプタマーは、目的のターゲットに結合するための正確な特異性を持つように開発できます。アプタマーは結合時に構造を変化させ、測定可能な電気化学的特性を変更します。アプタマーは、指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化（SELEX）プロセスによって生成されます。^[2] 電気化学アプタマーベース（E-AB）バイオセンサーは、アプタマーの電気化学的および生物学的特性を利用して、リアルタイムで生体内測定を行うデバイスです。

電気化学アプタマーベース（E-AB）バイオセンサーは、生体内での特定の標的結合に応答して電気化学信号を生成します^[3]。信号は、電極を通過するファラデー電流の変化によって測定されます。E-ABセンサーは、リアルタイム測定で生体内の標的結合を検出できるため、蛍光生成アプタマーなどの以前に報告されたアプタマーベースのセンサーよりも優れています。 ^[4] E-ABセンサーは、3つの電極セル（検査（または作業）電極、参照電極、および対電極）で構成されています。信号は電気化学セル内で生成され、ポテンショスタットによって測定および分析されます。^[5]いくつかの生化学的および電気化学的パラメーターが、E-ABバイオセンサーの信号ゲインを最適化します。DNAまたはRNAアプタマーの密度パッキング、ポテンショスタットによって管理されるACV周波数、および自己組織化単分子膜（SAM）の化学的性質はすべて、信号ゲインと標的結合の信号対雑音比を決定する要因です。^[3] E-ABバイオセンサーは、原位置センシング、フィードバック制御薬物投与、癌バイオマーカーのための有望なメカニズムを提供します。^[4]

DNAまたはRNAアプタマーは、照合電極上に固定され、酸化還元反応は酸化還元タグによって報告されます。金は、照合電極のプローブ表面としてよく使用されます。[ ^6]金電極の表面は、酸化還元タグ付き DNA または RNA アプタマーで満たされています。酸化還元レポーターは、多くの場合、メチレンブルーです。^[3]ターゲットが結合すると、アプタマーは折り畳まれて構造が変化し、酸化還元レポーターが金電極に近づきます。酸化還元レポーターから電極への近接性が増すと、酸化還元タグから金電極への電子移動が速くなります。^{[5]電子移動速度の増加は、ポテンショスタットによって検出される}ファラデー電流の変化に寄与します。

参照電極は、既知の酸化還元電位を持つ既知の化学反応の場所です。たとえば、銀-塩化銀 (Ag/AgCl) の反応を起こす参照電極は、固定された酸化還元電位を持ち、検査電極の酸化還元電位の測定点となります。^[7]対電極 (または補助電極) は、検査電極の陰極または陽極として機能します。^[5]印加電圧は、ポテンショスタットによって供給されるインピーダンスにより、参照電極を通過しません。したがって、電気化学セル内で生成される電位は、検査電極に起因します。電流は、検査電極の電位と参照電極の固定電位を対比して測定されます。電位差によって、外部回路に電流が生成され、信号が生成されます。信号は、ターゲット結合に化学量論的に比例する電子移動に応じて、ターゲット結合を定量化します。^[5]

4電極法は電気化学ナノ多孔性アルミナ膜センサーでも実証されており^[8] 、アプタマーは電極ではなく膜にグラフトされています。アプタマーが標的タンパク質に結合すると膜のインピーダンスが変化し、インピーダンス分光分析装置を使用して電気化学センサーによって検出されます。このアプローチは、電極の電界によってアプタマーの構造やバイオインターフェースが変化し、感知能力が低下する可能性がある場合に有益です。

結合誘起電気化学信号ゲインの最適化には、考慮すべきパラメータがいくつかあります。アプタマープローブの充填密度、自己組織化単分子膜の性質、およびACV周波数は、信号の検出と測定に影響を与える要因です。^[3] プローブ表面の充填密度を製造する際には、2つの主な要因が考慮されます。アプタマーの濃度と自己組織化単分子膜（SAM）の表面化学により、必要なプローブ充填密度を変えることができます。^[3]

電極表面のアプタマーの充填密度は、信号を最適化するための重要なパラメータです。標的分子のサイズと性質に応じて、異なるアプタマー充填密度が信号ゲインに有利になります。研究によると、小さな標的分子は低密度のアプタマー充填でより大きな信号ゲインを可能にし、標的としてのより大きなタンパク質は中程度のプローブ充填密度で最大の信号を生成します。^[3]立体障害により、充填密度が最適な信号ゲインの範囲を超えて増加すると、信号ゲインは減少します。アプタマーに隣接するプローブ表面が隣接するアプタマーによってブロックされると、標的に結合したアプタマーの酸化還元タグは電極と接触する余地がなくなり、標的結合を報告できなくなります。クリーンなプローブをインキュベートする溶液中のアプタマーの濃度は、プローブ上に固定されたアプタマーの密度に比例することがわかっています。^[3]研究では、コカイン E-AB センサーなどの小さな標的は、最も低いプローブ充填密度で最も多くの信号を生成することが示唆されています。逆に、トロンビンタンパク質のようなより大きなタンパク質標的は、中程度のプローブ充填密度で最も多くの信号を生成します。^[3]

続いて、プローブをSAMでインキュベートして、プローブの空いている表面をターゲットまたはさらなるアプタマー結合に対して非反応にします。^[3]最適化されたSAMの厚さは、表面がターゲット結合に対して不活性化されるのに十分な厚さであり、酸化還元レポーターから電極に電子を転送するのに十分な薄さです。SA​​Mの厚さは長さとして測定できます。コカインE-ABセンサーは、SAMが薄く導電性が高いほど多くの信号を生成することが報告されています。ただし、SAMを6炭素から2炭素に減らすと信号が減少し、6炭素SAMを使用してピーク電流が生成されます。^[3]

ACV周波数は、標的結合を定量化するファラデー電流をモニターするために使用されます。^{[3] ACVが感知可能な範囲内にある限り、つまり検出}できないほど低すぎず、速すぎない限り、信号の生成はACV周波数に影響を受けないと報告されています。^[3] ACV周波数は、電極の劣化を防ぐために、一方向電流の代わりに使用されます。方形波ボルタンメトリーを適用して測定し、電圧が電極全体で直線的に掃引されるときの電流の変化を分析します。^[9]

E-AB アプタマーの設計と製造は、以前に報告されたアプタマーに使用された方法と一致しています。SELEXは、ヌクレオチド アプタマーの製造と選択のためのよく知られた選択方法です。1990 年代に、科学者は SELEX を導入しました。アプタマーは、このプロセスを通じて、in vitro ターゲット認識に基づいて選択されます。SELEX では、アプタマーは特定のターゲットを認識する能力に基づいて選択されます。この方法には、3 つの重要なステップがあります。まず、一本鎖核酸がターゲットに結合します。次に、結合した核酸を結合していない核酸から分離します。最後に、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) によって、ターゲットに親和性を持つ核酸を増幅し、さらなるスクリーニングや機能分析を可能にします。SELEX に続いて、ハイスループット シーケンシングを使用して、ターゲット結合能力によって濃縮された配列を識別します。^[10] SELEX は、1 ラウンドで達成できる濃縮の量によって比較的制限されます。^[11]この制限を克服するアプタマー製造のためのあまり報告されていないスクリーニング法は、粒子ディスプレイと呼ばれる親和性ベースのライブラリエンリッチメントである。^[10]

粒子ディスプレイは、従来の選択方法よりも少ない回数で、より高親和性のアプタマーを高収量で生成します。^[10]この方法では、アプタマーのライブラリがアプタマー粒子に分離され、親和性に基づいて蛍光活性化セルソーティングによって分離されます。最も親和性の高いアプタマー粒子のみが単離され、アプタマーに配列決定されます。^[10]これは、SELEXなどの選択方法よりも効率的な親和性ベースの選択プロセスです。粒子ディスプレイは、ターゲット結合の親和性と特異性が高いため、E-ABセンサーの信頼性の高いアプタマー生成方法である可能性があります。

研究者らは、粒子ディスプレイシステム（PDS）を導入することにより、従来のSELEXで高親和性アプタマーを単離するという課題に取り組みました。^[10]モノクローナルアプタマーのスクリーニングに並列単一分子エマルジョンポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用するPDSは、エマルジョンPCRと液滴デジタルPCRを採用して副産物の増殖を防ぎ、希少な高親和性配列を保存します。 PDSの1粒子1配列の性質により、DNAとターゲットの相互作用が粒子とターゲットの相互作用に変換され、蛍光活性化セルソーティングまたはフローサイトメトリーアッセイによるアプタマー候補の親和性の迅速な確認が可能になります。 従来のSELEXとは異なり、PDSはアプタマーを効率的に分離し、高親和性バインダーを識別および単離するための合理的で効果的な方法を提供します。^[10] PDSは、高親和性アプタマーの濃縮効率を大幅に向上させ、これを1回のスクリーニングで達成します。

粒子ディスプレイは、従来の選択方法に比べて、より少ない回数で、より高親和性のアプタマーを大量に生成します。この方法では、アプタマー ライブラリをアプタマー粒子に分離し、蛍光活性化セル ソーティングを使用して、親和性に基づいて粒子を分離します。最も親和性の高いアプタマー粒子のみが分離され、アプタマーに配列されます。この親和性に基づく選択プロセスは、SELEX などの方法よりも効率的です。粒子ディスプレイは、ターゲット結合の親和性と特異性が高いため、E-AB センサーの信頼性の高いアプタマー生成方法である可能性があります。

EAB センサーは、代謝、内分泌学、薬物動態学、神経化学の理解を、貴重な研究ツールとして大幅に前進させる可能性を秘めています。具体的には、これらのセンサーは、薬物送達、クリアランス、代謝恒常性の維持などの現象の解像度を向上させ、より定量的な測定を可能にします。フィードバック制御機能を備えた EAB センサーは、たとえば血漿中の薬物濃度とその後の臨床または行動反応との相関関係を解明する前例のない機会も提供します。EAB センサーが複数の身体部位で同時に測定を行うことで、身体区画内および身体区画間の薬物および代謝物の輸送に関する理解を深めることができます。体内測定以外にも、EAB センサーは、小規模 (「チップ上の臓器」など) から産業規模 (産業用バイオリアクターの監視など) まで、細胞培養アプリケーションでのリアルタイム監視に役立つ可能性があります。アストロサイトにおける ATP 放出の監視や、ガラスナノピペットを使用した細胞培養におけるセロトニンの検出などのアプリケーションですでに有用性が実証されています。^[12]

「化学抗体」と呼ばれるアプタマーは、標的分子に対する特異的認識および結合能力があるため、治療およびバイオセンシングに使用されています。アプタマーは、従来の抗体に比べて大幅に軽量で、細胞内標的に容易に浸透し、合成生産が可能で、非免疫原性であり、安定性を示すという利点があります。^[13]アプタマーはタンパク質の識別に優れており、診断および治療において精度を発揮し、特に生体分子の精製、キラル分離、および生化学アッセイにおいて、実験室アッセイおよび分離に応用されています。^[14]アプタマーは構造変化を起こす能力があるため、抗体にはない柔軟性を発揮し、消光ベースのバイオセンサーの開発に最適です。^[15]交差反応性やバッチ変動を起こしやすい抗体とは異なり、アプタマーはカスタマイズ可能な選択性と安定性を提供します。^[13]これは、小分子などの低分子量のエンティティをターゲットとするバイオセンサーアプリケーションで特に顕著です 。

E-AB センサーでは、電気化学反応とターゲットの不在の間の信号は小さいです。アプタマーは、大規模な構造変化に合わせて再設計できます。長い柔軟なループまたは相補鎖によって、アプタマーの構造変化を強制することもできます。アプタマーを変更するこれらの技術により信号比は増加しますが、測定に十分であることは保証されません。

E-AB センサーの感度は、導入されたアプタマーの感度と同程度です。血液やその他の体液に類似の化合物が存在する場合、アプタマーの選択性が問題になることがあります。交差反応性は生体内モニタリングに干渉を引き起こすため、サンプル内に存在する可能性のある類似の化合物とアプタマーがどのように反応するかを理解する必要があります。

制御された薬物送達の基礎としてのE-ABバイオセンサー。E-AB信号計算を薬物投与医療機器に統合することにより、投与量レベルに基づいた継続的な薬物投与のためのフィードバック制御薬物送達。^[4] E-ABバイオセンサーは試薬を必要とせず、抗体検出法に比べて安価であり、^[16]非標的分子を多く含む血液やその他の体液でも使用でき、再利用可能です。これらすべての要因により、E-ABバイオセンサーは、コンピュータプログラミングの統合計算に依存するフィードバック制御薬物送達の有望な方法となっています。^[4]

EAB センサーは、代謝、内分泌学、薬物動態学、神経化学の理解を貴重な研究ツールとして大幅に前進させる可能性を秘めています。具体的には、これらのセンサーは、薬物送達、クリアランス、代謝恒常性の維持などの現象の解像度を向上させ、より定量的な測定を可能にします。^[17] E-AB センサーはフィードバック制御が可能なため、例えば血漿中の薬物濃度とその後の臨床反応または行動反応との相関関係を解明する前例のない機会も提供します。E-AB センサーが複数の身体部位で同時に測定を行うことで、身体区画内および身体区画間の薬物および代謝物の輸送に関する理解を深めることができます。^[17]体内測定以外にも、E-AB センサーは、小規模 (「チップ上の臓器」など) から産業規模 (産業用バイオリアクターの監視など) まで、細胞培養アプリケーションでのリアルタイム監視に役立つ可能性があります。アストロサイトにおける ATP 放出の監視や、ガラスナノピペットを使用した細胞培養におけるセロトニンの検出などのアプリケーションですでに有用性が実証されています。^{[18] [19]}

E-ABセンサーは、患者の健康状態をリアルタイムで監視するウェアラブルデバイスに組み込むことができます。E-ABセンサーは、病気の早期発見に役立つ特定のバイオマーカーを監視できます。たとえば、C反応性タンパク質の測定は、ウェアラブルデバイスでの心臓発作の検出に役立ちます。^[17]

E-ABセンサーは、複雑な生体内環境内で分子をモニタリングする画期的な可能性を提供し、臨床現場で革新的な応用が期待されています。持続血糖モニターに匹敵するウェアラブルデバイスにE-ABセンシングプラットフォームを統合することを想定すると、健康と病気を反映する薬物やバイオマーカーのリアルタイム測定が可能になります。特に、間質皮膚領域でのE-ABセンサーの調査は、この点で可能性を示しています。^[20]

敗血症が疑われる場合、C反応性タンパク質などの感染バイオマーカーのモニタリングは、潜在的に命を救うアプローチとして際立っており、病気の予後と重症度に関する重要な洞察を提供します。^[21]同様に、心臓リスクの高い人の場合、トロポニンなどの特定のバイオマーカーと心臓イベントの発症との関連性を考慮すると、便利なウェアラブルデバイスの導入により心臓発作の早期発見が容易になる可能性があります。^[22]複雑なサンプルマトリックス内で特定のタンパク質のピコモル濃度をリアルタイムで測定できるE-ABセンサーの優れた機能により、このプラットフォームはこのような臨床モニタリングアプリケーションに適したツールとしての地位を確立しています。

E-ABセンサーは、疾患検出だけにとどまらず、特に精密医療の分野で薬剤投与方法に革命を起こす可能性を秘めています。平均的な個人の薬剤吸収と反応に関する仮定に基づく薬剤投与の一般的なアプローチは、患者の変動性に比べて治療域が狭い薬剤には不十分です。^[17]ゆっくりとした頻度の低い採血や、観察可能な副作用を待つ現在の投与方法には、投与不足または投与過剰の潜在的なリスクが伴います。^[17] E-ABセンサーは、血漿薬剤レベルに関するリアルタイムの洞察を提供する機能を備えており、治療薬剤モニタリングを改善することで、薬物治療の安全性と有効性を大幅に向上させる手段を提供します。