化学イメージング

化学イメージング（定量的化学マッピングとも呼ばれる）は、スペクトルと空間的、時間的情報の同時測定から成分分布の視覚的イメージを作成する分析機能である。^{[ 1 ] [ 2 ]} ハイパースペクトルイメージングは​​連続したスペクトルバンドを測定するが、マルチスペクトルイメージングは​​間隔を空けたスペクトルバンドを測定する。^{[ 3 ]}

化学イメージングにおける基本的な考え方は、分析者が特定の化学成分について、ある空間位置と時間における測定データスペクトルをいくつでも取得できるというものです。これは、化学物質の同定と定量に役立ちます。あるいは、特定のデータスペクトル（PCA：波長、空間位置、時間における多変数データ）で画像平面を選択することで、サンプル成分の空間分布をマッピングできます。ただし、選択されたデータスペクトルにおいて、各成分のスペクトル特性が異なることが前提となります。

化学イメージング用ソフトウェアは最も特化しており、ケモメトリクスなどの化学的手法とは区別される。

イメージング装置は、試料を照射する光源、分光選択素子、そして通常は画像を収集する検出器アレイ（カメラ）の3つの構成要素から成ります。データ形式はハイパーキューブと呼ばれます。データセットは、2つの空間次元（xとy）にまたがる3次元のデータブロックであるデータキューブとして視覚化できます。このデータブロックは、一連の波長（ラムダ）によって3番目の（スペクトル）軸を構成します。ハイパーキューブは、視覚的にも数学的にも、一連のスペクトル分解画像（各画像平面は1つの波長における画像に対応）または一連の空間分解スペクトルとして扱うことができます。

市販の実験室用化学イメージングシステムは1990年代初頭に登場しました（参考文献1～5）。高度な電子機器や超高性能コンピュータの必要性といった経済的要因に加え、赤外線イメージングの商業化における大きな障壁は、赤外線画像を読み取るために必要な焦点面アレイ（FPA）が市販品として容易に入手できなかったことでした。高速電子機器や高性能コンピュータが普及し、赤外線カメラが容易に市販されるようになると、実験室用化学イメージングシステムが導入されるようになりました。

当初は専門の研究室における新規研究に用いられていた化学イメージングは​​、10年足らずで、一般的な研究開発、品質保証（QA）、品質管理（QC）に用いられる、より一般的な分析技術へと発展しました。医薬品、ポリマー、半導体、セキュリティ、法医学、農業など、様々な産業分野でこの技術が急速に普及した背景には、化学組成と形態の両方を特徴づける豊富な情報があります。化学イメージングデータの並列性により、単一サンプルの特性評価に加え、ハイスループット分析を必要とする用途において、複数のサンプルを同時に分析することが可能です。

ハイパースペクトルイメージングは^​​、固体またはゲル状サンプルに最もよく適用され、化学、生物学^{[ 4 ] [ 5][ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]}、医学^{[ 10 ] [ 11 ]、}薬学^{[ 12 ] [ 13 ]}（例えば、食品科学、バイオテクノロジー^{[ 14 ] [ 15 ] 、}農業、産業にも応用されている）に利用されている。近赤外線、赤外線、ラマン化学イメージングは​​、ハイパースペクトル、分光、スペクトル、またはマルチスペクトルイメージングとも呼ばれる（マイクロ分光法も参照）。ただし、UV-可視または蛍光マイクロ分光法を含む、他の超高感度かつ選択的なイメージング技術も使用されている。多くのイメージング技術は、生物学および医学における単一分子^{[ 16 ] [ 17 ]から細胞レベル[ 10 ​​] [ 18 ] [ 19 ]}、そして画像に至るまで、あらゆるサイズのサンプルを分析するために使用できる。天文学では惑星系を対象とするが、そのような大きく異なる系を観測するためには、異なる観測機器が用いられる。

化学勾配に依存して機能するあらゆる材料は、空間的特性と化学的特性を組み合わせた分析手法によって研究できる可能性がある。このような材料を効率的かつ効果的に設計・製造するには、「何」と「どこ」の両方を測定する必要がある。製造材料が複雑化するにつれて、この種の分析に対する需要は高まっている。化学イメージング技術は、現代の製造製品を理解する上で不可欠であり、場合によっては非破壊的な手法であるため、サンプルを保存してさらに試験を行うことができる。

人工的に作られたものも天然のものも含め、多くの物質はその機能性を試料成分の空間分布から得ています。例えば、徐放性医薬品製剤は、バリア層として機能するコーティングを用いることで実現できます。有効成分の放出はこのバリアの存在によって制御され、コーティングの不完全性（例えば不連続性）は性能の変化につながる可能性があります。半導体産業では、シリコンウェハやプリントされたマイクロ回路の不規則性や汚染物質が、これらの部品の故障につながる可能性があります。生物システムの機能もまた、化学勾配に依存しています。単一の細胞、組織、さらには臓器全体でさえ、非常に特殊な成分配置によって機能しているのです。化学組成や分布のわずかな変化でさえ、病気の早期兆候となる可能性があることが示されています。

化学イメージングは​​、振動分光法の基本原理を共有していますが、空間分解スペクトルを同時に取得することで、より多くの情報を提供します。これは、デジタルイメージングの利点と分光測定の特性を組み合わせたものです。簡単に言うと、振動分光法は光と物質の相互作用を測定します。試料と相互作用する光子は吸収されるか散乱されます。特定のエネルギーを持つ光子は吸収され、その吸収パターンから試料中に存在する分子に関する情報、つまり指紋が得られます。

一方、観測装置の構成に関して言えば、化学イメージングは​​、（光学的）吸収、発光（蛍光）、（光学的）透過、または散乱（ラマン）のいずれかのモードで実施できる。現在、蛍光（発光）モードとラマン散乱モードが最も感度が高く強力であるが、同時に最も高価であるという共通認識が存在する。

透過測定では、放射線が試料を透過し、試料の反対側に配置された検出器で測定されます。入射放射線から分子に伝達されるエネルギーは、光源から放出された光子の数と検出器で測定された光子の数の差として計算できます。拡散反射測定では、同じエネルギー差の測定が行われますが、光源と検出器は試料の同じ側に配置され、測定される光子は試料を透過するのではなく、照射された側から再び現れたものです。エネルギーは1つまたは複数の波長で測定できます。一連の測定が行われると、その応答曲線はスペクトルと呼ばれます。

スペクトル取得における重要な要素は、放射線が試料と相互作用する前または後に、何らかの方法でエネルギー選択される必要があることです。波長選択は、固定フィルター、可変フィルター、分光器、干渉計、またはその他の装置を用いて行うことができます。固定フィルターを用いる場合、多数の波長を効率的に収集することは難しく、通常はマルチスペクトルデータが収集されます。干渉計を用いた化学イメージングでは、スペクトル範囲全体を収集する必要があるため、ハイパースペクトルデータが得られます。可変フィルターは、分析要件に応じて、マルチスペクトルデータまたはハイパースペクトルデータのいずれかを提供できる柔軟性を備えています。

スペクトルは通常、焦点面アレイに基づくイメージング分光計を用いて測定される。

振動化学イメージング装置の種類

化学イメージングは​​、中赤外分光法、近赤外分光法、ラマン分光法に適用されてきた。バルク分光法と同様に、それぞれのイメージング技術には特有の長所と短所があり、異なるニーズを満たすのに最適である。

中赤外線化学イメージング

中赤外（MIR）分光法は、2,500～25,000 nmのスペクトル範囲で発生する基本的な分子振動をプローブします 。MIR領域における市販のイメージング実装では、用途に応じてハイパースペクトルイメージャーまたはフーリエ変換赤外（FT-IR）干渉計が使用されます。MIR吸収帯は比較的狭く、分解能が高いため、経験豊富な分光学者であれば直接スペクトルを解釈できる場合が多くあります。MIR分光法は、化学組成や構造の微妙な変化を識別できるため、未知の物質の同定によく用いられます。このスペクトル範囲の吸収は比較的強いため、MIR領域で入射する放射線と相互作用する物質の量を制限するために、サンプル提示が重要になります。データは、反射、透過、または発光モードで収集できます。水はMIR放射線を非常に強く吸収するため、湿潤サンプルでは高度なサンプリング手順（減衰全反射など）が必要になることがよくあります。市販の機器には、ポイントマッピング、ラインマッピング、およびイメージング機能があります。中赤外化学イメージングは​​、原子間力顕微鏡ベースの赤外分光法（AFM-IR）を使用してナノメートルレベルの空間分解能で実行することもできます。超短中赤外パルスを使用すると、中赤外の全帯域幅のハイパースペクトルイメージングを数秒以内に実現できます。^{[ 21 ]}

MIR顕微鏡の種類については、「顕微鏡#赤外線顕微鏡」を参照してください。

赤外線スペクトルの大気透過窓は、遠隔化学イメージングにも利用されます。これらのスペクトル領域では、大気中のガス（主に水とCO₂ _{）の吸収率が低いため、数キロメートル離れた場所からでも赤外線による観測が可能です。そして、上述の選択的吸収／放出プロセスを用いて、}標的分子を観測することができます。SF₆とNH₃_の同時放出を化学イメージングした例を画像に示します。

近赤外線化学イメージング

 分析用近赤外（NIR）領域は、780 nmから2,500 nmの範囲に及びます 。このスペクトル範囲に見られる吸収帯は、OH、NH、CH、SHの伸縮振動および曲げ振動の倍音と組み合わせ振動に由来します。NIRにおける吸収は中赤外（MIR）に比べて1～2桁小さいため、大掛かりな試料前処理は不要です。厚い試料も薄い試料も前処理なしで分析でき、一部の包装材を通してNIR化学画像を取得することも可能です。また、この技術は、一定の範囲内であれば、水和試料の検査にも使用できます。無傷の試料は、透過または拡散反射で画像化できます。

倍音帯と結合帯の線形は、MIR で見られる基本帯の線形よりもはるかに幅広く、重なり合っている傾向があります。多くの場合、サンプル成分のスペクトル特性を分離するために多変量法が使用されます。NIR 化学イメージングは​​、既知の材料の迅速で再現性のある非破壊分析を実行するのに特に役立ちます。^{[ 23 ] [ 24 ]} NIR イメージング装置は通常、ハイパースペクトル カメラ、チューナブル フィルター、または FT-IR 干渉計に基づいています。太陽光 (屋外スキャン、リモート センシング) やハロゲン ランプ (実験室、工業測定) などの外部光源が常に必要です。

ラマン化学イメージング

ラマンシフト化学イメージングのスペクトル範囲は約 50 ～ 4,000 cm⁻¹ に及びます^。 特定のラマン測定が行われる実際のスペクトル範囲は、レーザー励起周波数の関数です。ラマン分光法の基本原理は、MIR および NIR とは異なり、ラマンスペクトルの x 軸は、放射源として使用されるレーザーの周波数に対するエネルギーシフト (cm⁻¹ 単位) の関数として測定されます^。簡単に言うと、ラマンスペクトルは、入射光子の非弾性散乱によって生じます。これは、振動に伴う分極率の変化を必要としますが、振動に伴う双極子モーメントの変化を必要とする赤外線吸収とは異なります。最終的な結果は、MIR と類似しており、多くの場合補完的なスペクトル情報となります。ラマン効果は弱く、試料に入射する光子の約 10⁷ 個に 1 個だけが^ラマン散乱を起こします。有機材料と無機材料の両方がラマンスペクトルを持ち、一般的に化学的に特異的な鋭いバンドを生成します。蛍光は競合する現象であり、試料によっては、バルク分光法とイメージングの両方において、ラマン信号を圧倒する可能性がある。

ラマン化学イメージングでは、試料の前処理はほとんど、あるいは全く必要ありません。ただし、対象表面を露出させるために、試料を物理的に切断する必要があり、その際、できるだけ平坦な表面が得られるように注意が必要です。特定の測定に必要な条件によって、この手法の侵襲性のレベルが決まります。高出力レーザー光に敏感な試料は、分析中に損傷を受ける可能性があります。ラマン化学イメージングは​​試料中の水分に対して比較的感度が低いため、生物試料など水分を含む試料のイメージングに適しています。

イメージングの価値は、固体またはゲル／ゲル状サンプルにおける空間的不均一性を解像できる点にある。液体や懸濁液のイメージングは​​、サンプルが常に動いているため空間情報が平均化されてしまうことから、用途が限られる。ただし、蛍光相関マイクロ分光法やFLIM観察のように、単一分子を極めて高速な（光子）検出速度でモニタリングできる超高速記録技術を用いる場合は例外である。しかし、液体サンプルのハイスループット実験（マルチウェルプレートのイメージングなど）は、貴重な情報を提供できる。この場合、数千のスペクトルを並列に取得することで、単一サンプル内の空間的不均一性を探索するという一般的な方法ではなく、サンプル間の違いを比較することができる。

同様に、単一点分光計でも同じスペクトル情報が得られるため、真に均質なサンプルをイメージングしてもメリットはありません。もちろん、均質性の定義は、使用するイメージングシステムの空間分解能に依存します。波長が3～10マイクロメートルに及ぶMIRイメージングでは、理論的には5マイクロメートル程度の物体を分解できる可能性があります。現在の実験実装では、照明が干渉計によって提供されるため、サンプリング領域が制限されます。ラマンイメージングでは、1マイクロメートル未満の粒子を分解できる可能性がありますが、照明できるサンプル領域は著しく制限されます。ラマンイメージングでは、広い領域、ひいては大きなサンプルをイメージングすることは非現実的であると考えられています。FT-NIR化学/ハイパースペクトルイメージングは​​通常、より大きな物体（>10マイクロメートル）のみを分解し、照明光源が容易に入手できるため、大きなサンプルに適しています。しかし、FT-NIRマイクロ分光法は、生物学的サンプルにおいて約1.2マイクロメートルの分解能を実現できることが最近報告されている^{[ 10 ]。}さらに、2光子励起FCS実験では、特殊な同時光子計数セットアップにより、生体膜薄膜上で15ナノメートルの分解能を達成したことが報告されている。

• マルチスペクトル画像
• 紫外可視マイクロ分光法
• イメージング分光法
• ハイパースペクトルイメージング
• レーザー直接赤外線（LDIR）イメージング
• 熱赤外分光法
• AFM-IR（原子間力顕微鏡を用いた赤外分光法）

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• FLIMの応用例：「FLIMは、試料中の異なる蛍光色素や自家蛍光分子から発せられる蛍光を、たとえそれらの発光スペクトルが類似していても区別することができます。そのため、マルチラベル研究における蛍光色素の同定に最適です。FLIMは、複雑な校正手順なしに細胞内イオン濃度を測定したり（例えば、カルシウムグリーン）、蛍光色素の寿命の変化に基づいて蛍光色素の局所環境に関する情報を取得したりするためにも使用できます。」FLIMは、マイクロ分光/化学イメージングや顕微鏡研究において、生細胞内のタンパク質間相互作用、膜の特性、核酸との相互作用の空間的および時間的変化をモニタリングするためにもよく使用されます。
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