ウイルスメタゲノミクス

ウイルスメタゲノミクスは、メタゲノミクス技術を使用して、多様な環境サンプルや臨床サンプルからウイルスのゲノム物質を検出する。^{[1] [2]}ウイルスは最も豊富な生物学的実体であり、極めて多様である。しかし、配列決定されたウイルスはごく一部であり、分離および培養されたウイルスはさらに少ない。^{[1] [3]}ウイルスには普遍的に保存されたマーカー遺伝子がないため、ウイルスの配列決定は困難な場合があり、遺伝子ベースのアプローチには限界がある。^{[3] [4]}メタゲノミクスは培養できないウイルスの研究と分析に使用でき、ウイルスの多様性と存在量を理解し、新しいウイルスを発見するための重要なツールとなっている。^{[1] [5] [6]}たとえば、メタゲノミクス手法は、癌性腫瘍や陸生生態系に関連するウイルスを説明するために使用されている。^[7]

ウイルスを発見、特徴づけ、分類する従来の方法は、サンプルからウイルス粒子またはその核酸を分離することに基づいていました。^[8]ウイルスの形態は電子顕微鏡を使用して視覚化できますが、ウイルスを検出できるほど高い力価で分離できる場合に限られます。ウイルスは真核細胞株または細菌で培養できますが、適切な宿主細胞の種類がわかっている場合に限られます。また、ウイルスの核酸はPCRを使用して検出できますが、コンセンサスプライマーがわかっている場合に限られます。^[8]

メタゲノミクスでは、普遍的なマーカー遺伝子、プライマー、プローブの設計を必要としないため、ウイルスゲノムに関する事前の知識は必要ありません。^[9]この方法では、サンプルのウイルス含有量を検出するために予測ツールを使用するため、新しいウイルス種や既知の種の異なるメンバーを識別するために使用できます。

ウイルスに関する最も初期のメタゲノム研究は、2002年に海洋サンプルで実施されました。参照配列と一致した配列は、主に二本鎖DNAバクテリオファージと二本鎖藻類ウイルスでした。^[10]

2016年に 国際ウイルス分類委員会（ICTV）は、メタゲノムデータから組み立てられたウイルスゲノムは、古典的なウイルス学的アプローチで分離されたウイルスと同じ手順を使用して分類できることを正式に認めました。^[11]

2002年のメタゲノミクス研究では、DNAおよびRNAウイルスの配列の65％が参照データベースと一致しないことが研究者によって発見されました。^[10]配列参照データベースでウイルス配列が一致しないこの現象は、ウイルスメタゲノミクス研究でよく見られ、「ウイルスダークマター」と呼ばれています。^{[3] [8]}これは主に、参照データベースに多様なサンプルの完全なウイルスゲノム配列がないことと、ウイルスの進化の速度が速いことが原因です。^{[3] [8]}

これらの課題に加えて、ボルチモア分類システムでは、ウイルスをゲノム構造と転写方法に基づいて分類し、二本鎖 DNA ウイルス、一本鎖 DNA ウイルス、二本鎖 RNA ウイルス、一本鎖 RNA ウイルスの 7 つのクラスに分類しています。^[12]一本鎖 RNA はプラス鎖またはマイナス鎖です。これらの異なる核酸タイプには異なるシーケンス手法が必要であり、すべてのウイルスタイプで保存されている普遍的な遺伝子マーカーはありません。^{[3] [4]}遺伝子ベースのアプローチは、特定のグループのウイルスのみをターゲットにすることができます (保存された RNA ポリメラーゼ配列を共有する RNA ウイルスなど)。^{[3] [4]}

参照データベースでは依然としてDNAウイルスに偏りがある。この偏りの一般的な理由は、RNAウイルスはDNAウイルスよりも急速に変異すること、DNAはサンプルから扱いやすいのに対しRNAは不安定であること、RNAメタゲノミクス解析（逆転写）にはより多くの手順が必要であることなどである。^{[4] [8]}

配列は宿主生物の配列で汚染される可能性があり、ウイルスの宿主生物が不明な場合は特に問題となる。^[4]核酸抽出やPCRによる汚染もある可能性がある。^[4]

メタゲノム解析では、全ゲノムショットガンシークエンシングを使用して、臨床サンプルと環境サンプル中の微生物の多様性を特徴付けます。サンプルから全DNAおよび/またはRNAを抽出し、シークエンシング用のDNAまたはRNAライブラリに準備します。^{[9]これらの方法は}、エプスタイン・バーウイルス（EBV）およびHCVの全ゲノムをシークエンシングするために使用されていますが、宿主核酸の汚染により、標的ウイルスゲノムに対する感度が影響を受け、標的配列に関連するリードの割合が低くなることがよくあります。^{[13] [14]}

IMG/VRシステムとIMG/VR v.2.0は、760,000以上のメタゲノムウイルス配列と分離ウイルスを収録した最大のインタラクティブな公開ウイルスデータベースであり、メタゲノムサンプルから得られたウイルス断片の配列解析の出発点として機能します。^{[15] [16]}

非標的メタゲノミクスとメタトランスクリプトミクスには遺伝子マーカーは必要ありませんが、アンプリコンシーケンシングには必要です。アンプリコンシーケンシングでは、遺伝子マーカーとして高度に保存された遺伝子を使用しますが、核酸の種類が多様なため、使用するマーカーは特定のウイルスグループ用のものでなければなりません。^{[3] [4]}これは、既知の高度に保存されたヌクレオチド配列に相補的なプライマーのPCR増幅によって行われます。^[9] PCRの後に全ゲノムシーケンシング法が続き、エボラウイルス^[17]、 ジカウイルス^[18]、COVID-19 ^[19]の流行を追跡するために使用されています。PCRアンプリコンシーケンシングは、低濃度のサンプルの全ゲノムシーケンシングでより成功しています。ただし、ウイルスゲノムが大きい場合やRNAウイルスが不均一である場合は、すべての遺伝子型の増幅をカバーするために複数の重複するプライマーが必要になることがあります。 PCRアンプリコンシークエンシングでは、シークエンシング前のウイルスゲノムの知識、適切なプライマーが必要であり、ウイルス力価に大きく依存しますが、比較的小さなゲノムを持つ既知のウイルスを研究する場合、PCRアンプリコンシークエンシングはメタゲノムシークエンシングよりも安価な評価方法です。^[9]

ターゲットエンリッチメントは、病原体の参照配列に相補的な小さなRNAまたはDNAプローブを使用してサンプルから直接ウイルスゲノムを配列決定する、培養に依存しない方法です。プローブは固相に結合し、サンプル内の相補的なDNA配列を捕捉してプルダウンすることができます。^[9]重複プローブの存在によりプライマーの不一致に対する許容度が高まりますが、その設計には高いコストと時間がかかるため、迅速な対応は限られています。DNA捕捉の後、簡単なPCRサイクリングとショットガンシーケンシングが行われます。この方法の成功は、プローブを作成するために利用できる参照配列に依存しており、新しいウイルスの特性評価には適していません。^{[9]この方法は、} HCV、^[14] HSV-1、^[20]およびHCMVなどの大小のウイルスの特性評価に使用されています。^[21]

ウイルスのメタゲノミクス法では、誤ったキメラ配列が生成されることがあります。^{[22] [23]これらには、増幅による}in vitroアーティファクトやアセンブリによるin silicoアーティファクトが含まれます。 ^{[23]キメラ}は、無関係なウイルス間だけでなく、ウイルスと真核生物の配列間でも形成される可能性があります。 [23]エラーの可能性は、シーケンスの深度を深くすることで部分的に軽減されますが、読み取りが高度に断片化されている場合は、カバレッジの高い領域でもキメラが形成される可能性があります。^[22]

植物ウイルスは作物生産に世界的な脅威をもたらしますが、メタゲノム配列解析とウイルスデータベースの作成により、改変された植物ウイルスは植物の免疫力を高め、外観を変えるために使用できます。^[24]メタゲノム配列解析から得られた植物ウイルスゲノムのデータを使用して、クローンウイルスを作成し、植物に接種して、ウイルス成分とウイルス因子の生物学的特性を再現性を高めて研究することができます。改変された変異ウイルス株は、さまざまな観賞用植物の色とサイズを変え、作物の健康を促進するために使用されています。^[25]

ウイルスメタゲノミクスは、培養に基づく方法論を必要とせずにウイルスの分類に貢献し、あらゆるシステムにおけるウイルスの多様性に関する膨大な洞察を提供してきました。メタゲノミクスは、特定の生態系に対するウイルスの影響とそれがマイクロバイオームに与える影響を研究するために使用できます。また、生態系内のウイルスを監視して、人間集団への流出の可能性を調べることもできます。 ^[1]生態系内では、ウイルスが互いにどのように競合するか、およびウイルスが宿主の機能に与える影響を調べるために研究できます。ウイルスメタゲノミクスは、海洋および土壌生態系における培養不可能なウイルス群集の研究に使用されています。^{[7] [26]}

ウイルスメタゲノミクスは、主に人獣共通感染性またはヒトに病原性のあるウイルスの発見に利用されています。メタゲノミクスから得られるウイルスデータベースは、ウイルス感染を判定するだけでなく、臨床サンプル中の薬剤耐性変異体を判定するための迅速な対応方法を提供します。^[9]ウイルス分類へのウイルスメタゲノミクスの貢献は、パンデミック監視の取り組みを支援し、感染症の監視と検査をより手頃な価格にしました。^[27]人間のパンデミックの大部分は人獣共通感染性であるため、メタゲノミクス監視により、新しいウイルスとそのリザーバーをより迅速に特定できます。^[28]

そのような監視プログラムの一つが、カリフォルニア大学デービス校のワンヘルス研究所を拠点とする国際共同研究イニシアチブであるグローバル・バイローム・プロジェクト（GVP）である。^{[29] [30]} GVPは、高リスク国で低コストのシークエンシング方法を使用して、病気の発生を防ぎ、将来のウイルスの発生を防ぐことで、世界中の感染症監視を強化することを目指している。^{[27] [31]}

ウイルスメタゲノミクスは、ウイルス関連の癌や臨床診断で診断が難しい症例の検査に使用されています。^[31]この方法は、従来の分子検査や高度な分子検査で病気の原因物質が見つからない場合に最もよく使用されます。メタゲノム配列決定は、臨床サンプル中の病原性ウイルスを検出し、集団内の病原体の存在に関するリアルタイムデータを提供するためにも使用できます。^[28]

臨床ウイルスメタゲノミクスに使用される方法は標準化されていないが、欧州臨床ウイルス学会によってガイドラインが発行されている。^{[32] [33]}臨床ウイルスメタゲノミクスにはさまざまなシーケンシングプラットフォームが使用されており、最も一般的なのはイルミナとオックスフォードナノポアテクノロジーの機器である。また、ウェットラボ作業とバイオインフォマティクス分析の両方で、いくつかの異なるプロトコルが使用されている。^[34]

• 疫学と下水
• 病理学

• IMG/VR IMG ウイルス データベース (IMG/VR)。
• CAMERA 2012-05-14 にWayback Machineでアーカイブされました。メタゲノミクスのためのサイバーインフラストラクチャ、メタゲノミクス研究のためのデータ リポジトリおよびツール。
• GOLD ゲノムオンラインデータベース (GOLD)。
• IMG/M DOE-JGI によるメタゲノム解析のための統合微生物ゲノム システム。
• MEGAN 2010-05-07 にWayback MachineでアーカイブされましたMEtaGenome ANalyzer。スタンドアロンのメタゲノム解析ツール。
• MetaGeneMark メタゲノム遺伝子検索のためのMetaGeneMark
• メタゲノミクスと私たちの微生物惑星 2014-03-26 にWayback Machineにアーカイブ全米科学アカデミーによる、メタゲノミクスと地球上の微生物の重要な役割に関する Web サイト。
• 欧州バイオインフォマティクス研究所におけるメタゲノム解析 メタゲノムデータの分析とアーカイブ化。
• メタゲノミクス: 環境からの配列の無料電子書籍、NCBI Bookshelf から。
• MG-RAST サブシステムテクノロジーサーバーを使用したメタゲノミクス高速アノテーション
• メタゲノミクスの新科学: 微生物惑星の秘密を解き明かす 2007 年 3 月に国立研究会議が発表したレポート。また、レポートの概要もご覧ください。2010 年 4 月 15 日にWayback Machineにアーカイブされました。
• http://www.globalviromeproject.org/ グローバル・バイロム・プロジェクトの公式サイト
• https://www.usaid.gov/ept2 新興パンデミック脅威プログラム EPT-2
• https://www.ecohealthalliance.org/program/predict