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細胞培養におけるアミノ酸による安定同位体標識（SILAC ）は、非放射性同位体標識を使用してサンプル間のタンパク質存在量の差を検出する質量分析法に基づく技術です。[1] [2] [3] [4]これは定量的プロテオミクスでよく使用される方法です。
手順
2 つの細胞集団が細胞培養で培養されます。細胞集団の 1 つには、通常のアミノ酸を含む成長培地が与えられます。一方、2 つ目の集団には、安定した (非放射性の) 重同位体で標識されたアミノ酸を含む成長培地が与えられます。たとえば、培地には、通常の炭素 12 ( 12 C) の代わりに、 6 つの炭素 13原子 ( 13 C) で標識されたアルギニンを含めることができます。この培地で細胞が成長すると、細胞は重いアルギニンをすべてのタンパク質に組み込みます。その後、単一のアルギニンを含むすべてのペプチドは、通常のペプチドよりも6 Da重くなります。あるいは、 13 C または15 N で均一に標識することもできます。両方の細胞集団からのタンパク質を組み合わせて質量分析で一緒に分析します。これは、異なる安定同位体組成の化学的に同一のペプチドのペアは、質量の差に基づいて質量分析計で区別できるためです。このようなペプチドペアの質量スペクトルのピーク強度の比は、2つのタンパク質の存在比を反映しています。[5] [3]
アプリケーション
通常の炭素12（12 C）の代わりに9つの炭素13原子（13 C）で標識されたチロシンを組み込むSILACアプローチは、シグナル伝達経路におけるチロシンキナーゼ基質の研究に利用されてきた。[6] SILACは、細胞シグナル伝達、リン酸化などの翻訳後修飾、[6] [7]タンパク質間相互作用、遺伝子発現の調節を研究するための非常に強力な方法として浮上してきた。さらに、SILACは、分泌タンパク質と分泌経路の包括的な研究であるセクレトミクスにおいて重要な方法となっている。 [8]これは、培養細胞によって分泌されたタンパク質と血清汚染物質を区別するために使用できる。[9]これはまた、宿主と微生物を同時に標識するための「順方向+逆方向」SILAC法としても適応されており、これにより宿主-微生物相互作用の研究が可能になる。[10]さまざまな用途向けのSILACの標準化されたプロトコルも公開されている。[11] [12]
パルスSILAC
パルスSILAC（pSILAC）はSILAC法のバリエーションで、標識アミノ酸を成長培地に短時間だけ添加する。これにより、生の濃度ではなく、de novoタンパク質生産の違いをモニタリングすることができる。 [13] [14]
ニューコードSILAC
従来、SILAC の多重化レベルは、利用可能な SILAC 同位体の数によって制限されていました。最近、NeuCode (中性子エンコード) SILAC と呼ばれる新しい技術により、代謝標識で達成可能な多重化レベルが強化されました (最大 4)。[15] NeuCode アミノ酸法は SILAC に似ていますが、標識に重いアミノ酸のみを使用する点が異なります。重いアミノ酸のみを使用すると、SILAC に必要なアミノ酸を 100% 組み込む必要がなくなります。NeuCode アミノ酸の多重化能力の向上は、安定同位体の余分な中性子による質量欠損の使用によるものです。ただし、これらの小さな質量差は、高解像度の質量分析計で解決する必要があります。
参考文献
- ^ Oda Y, Huang K, Cross FR, Cowburn D, Chait BT (1999年6月). 「タンパク質発現と部位特異的リン酸化の正確な定量」.米国科学アカデミー紀要. 96 (12): 6591– 6596. Bibcode :1999PNAS...96.6591O. doi : 10.1073/pnas.96.12.6591 . PMC 21959. PMID 10359756.
- ^ Jiang H, English AM (2002). 「同位体標識ロイシンの組み込みによる酵母プロテオームの定量分析」。Journal of Proteome Research . 1 (4): 345– 350. doi :10.1021/pr025523f. PMID 12645890.
- ^ ab Ong SE、Blagoev B、Kratchmarova I、Kristensen DB、Steen H、Pandey A、Mann M (2002 年 5 月)。「細胞培養におけるアミノ酸による安定同位体標識 (SILAC) は、発現プロテオミクスへのシンプルで正確なアプローチです」。Molecular & Cellular Proteomics。1 ( 5 ): 376– 386。doi : 10.1074/mcp.M200025-MCP200。PMID 12118079。
- ^ Zhu H, Pan S, Gu S, Bradbury EM, Chen X (2002). 「定量的プロテオミクスのためのアミノ酸残基特異的安定同位体標識」Rapid Communications in Mass Spectrometry . 16 (22): 2115– 2123. Bibcode :2002RCMS...16.2115Z. doi :10.1002/rcm.831. PMID 12415544.
- ^ シェーターズ F、ファン・ダイク P (2019). 「カンジダ・アルビカンスにおけるタンパク質間相互作用」。微生物学のフロンティア。10 : 1792.土井: 10.3389/fmicb.2019.01792。PMC 6693483。PMID 31440220。
- ^ ab Ibarrola N、Molina H、Iwahori A、Pandey A (2004年4月)。「[13C]チロシンを用いたチロシンキナーゼ基質の特異的同定のための新しいプロテオミクスアプローチ」。The Journal of Biological Chemistry。279 ( 16): 15805– 15813。doi : 10.1074/jbc.M311714200。PMID 14739304。
- ^ Ibarrola N、Kalume DE、 Gronborg M、Iwahori A、Pandey A (2003 年 11 月)。「細胞培養における安定同位体標識を用いたリン酸化の定量化のためのプロテオミクスアプローチ」。分析化学。75 (22): 6043– 6049。doi :10.1021/ac034931f。PMID 14615979 。
- ^ Hathout Y (2007 年 4 月). 「細胞セクレトームの研究へのアプローチ」. Expert Review of Proteomics . 4 (2): 239– 248. doi :10.1586/14789450.4.2.239. PMID 17425459. S2CID 26169223.
- ^ Polacek M、Bruun JA、Johansen O、Martinez I (2010 年 8 月)。「SILAC 技術によって明らかになった軟骨組織片と培養軟骨細胞のセクレトームの違い」。Journal of Orthopaedic Research。28 ( 8 ): 1040– 1049。doi : 10.1002/ jor.21067。PMID 20108312。S2CID 41057768 。
- ^ Liu, Yang Sylvia; Zhang, Chengqian; Khoo, Bee Luan; Hao, Piliang; Chua, Song Lin (2024-09-02). 「2種プロテオミクスと動物-病原体相互作用の標的介入」。Journal of Advanced Research。doi : 10.1016 / j.jare.2024.08.038。ISSN 2090-1232。
- ^ Amanchy R、Kalume DE、Pandey A ( 2005年 1 月)。「細胞培養におけるアミノ酸による安定同位体標識 (SILAC) によるタンパク質存在量と翻訳後修飾のダイナミクスの研究」。Science 誌STKE。2005 ( 267): pl2。doi : 10.1126 /stke.2672005pl2。PMID 15657263。S2CID 12089034。
- ^ Harsha HC、Molina H 、 Pandey A (2008)。「細胞培養におけるアミノ酸の安定同位体標識を用いた定量的プロテオミクス」。Nature Protocols。3 ( 3): 505– 516。doi : 10.1038 / nprot.2008.2。PMID 18323819。S2CID 24190501 。
- ^ Schwanhäusser B、Gossen M、Dittmar G 、Selbach M (2009 年 1 月)。「パルス SILAC による細胞タンパク質翻訳の包括的解析」。プロテオミクス。9 (1): 205– 209。doi : 10.1002/pmic.200800275。PMID 19053139。S2CID 23130202。
- ^ チュア、ソン・リン;ヤム、ジョーイ・クオク・フン。ハオ、ピリャン。アダブ、スニル S.サリド、メイ・マーガレット。劉、楊。ギブスコフ、マイケル。シウ・クワン;トルカー・ニールセン、ティム;ヤン、リャン (2016-02-19)。 「緑膿菌バイオフィルムにおける抗生物質耐性細菌集団の選択的標識と根絶」。ネイチャーコミュニケーションズ。7 (1): 10750.土井:10.1038/ncomms10750. ISSN 2041-1723。PMC 4762895。
- ^ Merrill AE、 Hebert AS、MacGilvray ME、Rose CM、Bailey DJ、Bradley JC、他 (2014 年 9 月)。「相対タンパク質定量のための NeuCode ラベル」。分子・細胞プロテオミクス。13 (9): 2503– 2512。doi : 10.1074/ mcp.M114.040287。PMC 4159665。PMID 24938287 。
さらに読む
- Ong SE、Kratchmarova I 、 Mann M (2003)。 「細胞培養におけるアミノ酸による安定同位体標識 (SILAC) における 13C 置換アルギニンの特性」。Journal of Proteome Research。2 ( 2): 173– 181。doi :10.1021/pr0255708。PMID 12716131 。
- Ong SE 、 Mann M (2006)。「細胞培養におけるアミノ酸による安定同位体標識の実用的レシピ (SILAC)」。Nature Protocols。1 ( 6): 2650– 2660。doi :10.1038 / nprot.2006.427。PMID 17406521。S2CID 10651610 。
- Ong SE、Mann M (2007)。「細胞培養におけるアミノ酸による安定同位体標識による定量的プロテオミクス」。質量分析による定量的プロテオミクス。分子生物学の方法。第359巻。pp. 37 ～ 52。doi :10.1007 / 978-1-59745-255-7_3。ISBN 978-1-58829-571-2. PMID 17484109。
外部リンク
- SILAC リソース マンラボ
- SILAC リソース Pandey Lab
- SILAC リソース 実験バイオインフォマティクスセンター (CEBI)