ラセミ結晶学

ラセミ結晶学は構造生物学で使用される技術であり、天然キラリティーのLタンパク質分子とその鏡像であるDタンパク質の等モル混合物からタンパク質分子の結晶を開発します。^[1]^[2] Lタンパク質分子は「左利き」のLアミノ酸とアキラルアミノ酸のグリシンで構成され、鏡像のDタンパク質分子は「右利き」のDアミノ酸とグリシンで構成されます。通常、Lタンパク質とDタンパク質の両方が全化学合成によって調製されます。

製造業

保護されていないペプチドセグメントのネイティブ化学ライゲーションは、タンパク質のポリペプチド鎖を調製するために使用され、その後、折り畳まれてタンパク質分子を形成します。^[1]ネイティブ化学ライゲーションでは、ペプチド C 末端チオエステルが、N 末端にシステイン残基を持つ 2 番目のペプチドと反応して、ライゲーション部位にペプチド結合を持つ生成物を生成します。^[3]複数の保護されていないペプチドセグメントをこのように連結して全長のポリペプチド鎖を得ることができ、これが折り畳まれて標的タンパク質分子が得られます。L タンパク質の化学合成が達成されると、D アミノ酸とグリシンから作られた合成ペプチド構成要素を使用して、D タンパク質エナンチオマーを製造できます。^[1] 収束合成は、ペプチドヒドラジドを使用して長いポリペプチド鎖を調製するのに最も効果的です。この場合、ヒドラジドは、ネイティブ化学ライゲーションで使用するためにチオエステルに変換できます。ヒドラジドは天然化学連結反応条件に対して安定しており、次の天然化学連結縮合反応のために反応性ペプチドチオエステルにその場で変換することができる。^[4]

理論

物体を規則的な三次元配列に配置する方法は、わずか 230 種類あります。分子結晶学では、これらの配置は「空間群」と呼ばれます。ただし、これらの配置のうち、キラルな物体またはキラルな分子がアクセスできるのは 65 種類だけです。残りの 165 の空間群には対称中心または鏡面が含まれているため、キラル分子である天然の球状タンパク質はアクセスできません。Wukowitz と Yeates は、球状タンパク質が特定の空間群で結晶化する好みを説明する数学理論を開発しました。彼らは、好ましい空間群は自由度 (D) の数、つまり特定の対称性が形成される容易さの尺度としての次元数によって決まると示唆しました。彼らはキラル空間群とアキラル空間群の両方の自由度の数を分析し、D = 8 の空間群 P1(bar) が理論的に最も支配的な空間群であることがわかりました。アキラル空間群はキラル空間群に比べて自由度が高いため、タンパク質エナンチオマーのラセミ混合物は、アキラルな{Lタンパク質とDタンパク質}ペアを形成することで、天然のLタンパク質単独に比べて結晶化しやすくなると予測した。空間群P1(bar)が最も好ましいが、P21/cとC2/cも非常に好ましい。一方、他のアキラル空間群は出現頻度が低いと予想される。したがって、P1(bar)、P21/c、およびC2/cは、ラセミ混合物における共通の中心対称空間群であると考えられている。^[1]

開発と応用

歴史

1989年、アラン・マッケイは、化学合成法を用いてLタンパク質とDタンパク質のエナンチオマーを作れるなら、ラセミ混合物を使って中心対称空間群のタンパク質を結晶化できると示唆した。彼は、中心対称結晶から得られるX線回折データでは、対角線外の位相が打ち消されて180度異なる位相が得られるため、X線結晶構造解析によるタンパク質構造決定における位相問題の解決が容易になると述べた。^[4]

1993年、ローラ・ザワツケとジェレミー・バーグは、初めて小さな（45アミノ酸）タンパク質ルブレドキシンを使用してラセミ体で合成しました。これは、ラセミ混合物からの成長を必要とする中心対称結晶からの回折データを使用することで、構造決定がより容易かつ堅牢になる可能性があるために行われました。ラセミタンパク質ペアによって形成される対称中心を持つことで、データ分析における位相回折の手順がさらに簡素化されます。^[5]前述のように、1995年にステファニー・ウコビッツとトッド・イェイツは、タンパク質分子が他の空間群よりも特定の空間群でより頻繁に結晶化する傾向がある理由を説明する数学理論を開発しました。彼らは、最も好ましいタンパク質空間群はP1<bar>であると予測し、球状タンパク質はラセミタンパク質混合物からラセミ体としてより容易に結晶化すると予測しました。^[6]

注目すべきアプリケーション

1994 年にネイティブ化学連結法が開発され、D タンパク質と L タンパク質の鏡像異性体ペアの全化学合成が可能になりました。未知の構造を解明するための最初の実用的な応用では、ラセミおよび準ラセミ X 線結晶構造解析が、雪ノミの不凍タンパク質の構造を決定するために使用されました。その作業の過程で、ラセミおよび準ラセミのタンパク質混合物でさえ、回折品質の中心対称結晶の形成を劇的に促進することが観察されました。準ラセミ体は、真の鏡像異性体ではないが、十分に類似した鏡像オブジェクトであるため、整然とした擬似中心対称配列を形成する鏡像タンパク質分子によって形成されます。^[4]

その後、全化学合成によって調製されたラセミ体および準ラセミ体のタンパク質分子のペアは、広範囲の球状タンパク質分子から回折品質の結晶を形成する成功率を劇的に向上させることが示されました。^[7]

結核菌のタンパク質である Rv1738 は、結核菌が持続休眠状態に入るときに最もアップレギュレーションされる遺伝子産物です。組み換え発現された Rv1738 L タンパク質の調製物は、結晶を形成するための広範な試みに抵抗しました。化学的に合成された Rv1738 の D タンパク質と L タンパク質の形態のラセミ混合物は、中心対称空間群 C2/c で結晶を与えました。中心対称空間群に L タンパク質と D タンパク質の二量体を含む構造は、リボソームに結合して翻訳を抑制できる「冬眠促進因子」と構造的に類似していることが明らかになりました。^[8]

ユビキチンタンパク質の結晶化はラセミ結晶学を用いて成功しました。D-ユビキチンまたはL-ユビキチンのいずれか単独の結晶化は困難ですが、D-ユビキチンとL-ユビキチンのラセミ混合物は容易に結晶化され、標準的な市販の結晶化スクリーニングでテストされた条件のほぼ半分で一晩で回折品質の結晶が得られました。^[4]

ジスルフィド含有マイクロタンパク質分子のラセミ体の結晶化を利用して、トリプシン阻害剤SFTI-1（アミノ酸14個、ジスルフィド1個）、コノトキシンcVc1.1（アミノ酸22個、ジスルフィド2個）、シクロチドkB1（アミノ酸29個、ジスルフィド3個）の構造を決定した。X線回折法を用いて、ラセミ体が中心対称空間群P3(bar)、Pbca、P1(bar)で結晶化することが判明した。^[4]

興味深いことに、アキラルな「ペプトイド」鎖はラセミ体として折り畳まれ、非常に好ましい中心対称空間群で結晶化することがわかりました。

血管内皮細胞増殖因子 A (VEGF-A)とのヘテロキラル D タンパク質複合体のラセミ体の高解像度結晶構造。VEGF-A の鏡像 D タンパク質形態は、ナノモル親和性を持つ 56 残基の L タンパク質結合剤を特定するためにファージディスプレイで使用されました。化学的に合成された D タンパク質結合剤は、VEGF-A の L タンパク質形態に対して同じ親和性を持っていました。D-VEGF-A、L-VEGF-A、および D タンパク質結合剤と L タンパク質結合剤のそれぞれ 2 等量からなる化学的に合成されたタンパク質の混合物は、中心対称空間群 P21/n でラセミ結晶を与えました。この 71kDa ヘテロキラルタンパク質複合体の構造は、1.6 Å の解像度で解読されました^[4]

参考文献

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[:02-1] Yeates TO, Kent SB (2012-06-09). 「ラセミタンパク質結晶学」. Annual Review of Biophysics . 41 (1): 41–61. doi :10.1146/annurev-biophys-050511-102333. PMID 22443988.

[2] Matthews BW (2009 年 6 月). 「ラセミ結晶学 - 簡単な結晶と簡単な構造: 気に入らない点は何もない?」.タンパク質科学. 18 (6): 1135–1138. doi :10.1002/pro.125. PMC 2774423. PMID 19472321 .

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[:1-4] Kent SB (2018年10月). 「化学タンパク質合成によって可能になるラセミおよび準ラセミタンパク質結晶構造解析」. Current Opinion in Chemical Biology . 合成生物学/合成生体分子. 46 : 1–9. doi :10.1016/j.cbpa.2018.03.012. PMID 29626784. S2CID 4680759.

[5] ^ Zawadzke LE、 Berg JM (1993年7 月)。「中心対称タンパク質結晶の構造」。タンパク質。16 (3): 301–305。doi : 10.1002/prot.340160308。PMID 8346193。S2CID 34216468。

[6] Wukovitz SW、Yeates TO (1995 年 12 月)。「タンパク質結晶が他の空間群よりも一部の空間群を好む理由」。Nature Structural Biology。2 ( 12 ) : 1062–1067。doi : 10.1038 /nsb1295-1062。PMID 8846217。S2CID 22994029。

[7] Yan B、Ye L、Xu W、Liu L（2017年9月）。「ラセミタンパク質結晶学の最近の進歩」。生物有機化学および医薬化学。ペプチドおよびタンパク質ライゲーション。25 （18）：4953–4965。doi ：10.1016/ j.bmc.2017.05.020。PMID 28705433 。

[8] Bunker RD、Mandal K、Bashiri G、Chaston JJ、Pentelute BL、Lott JS、他 (2015 年 4 月)。「ラセミタンパク質結晶構造解析により示唆される結核菌の持続における Rv1738 の機能的役割」。米国科学アカデミー紀要。112 (14): 4310–4315。Bibcode : 2015PNAS..112.4310B。doi : 10.1073 / pnas.1422387112。PMC 4394262。PMID 25831534。