光学マッピング

光学マッピング^[1]は、単一の染色された DNA 分子から、整然としたゲノム全体の高解像度の制限地図を作成する技術で、「光学マップ」と呼ばれます。生物の未知の DNA に沿って制限酵素部位の位置をマッピングすることにより、結果として得られる DNA 断片のスペクトルは、その配列の固有の「指紋」または「バーコード」として集合的に機能します。この方法は、1990 年代に David C. Schwartz 博士とニューヨーク大学の彼の研究室によって最初に開発され^[2]、それ以来、微生物と真核生物のゲノムの両方に対する多くの大規模な配列決定プロジェクトのアセンブリプロセスに不可欠なものとなっています。その後の技術では、光学マッピングを作成するために、 ^{DNA 融解[3]} 、 DNA 競合結合^[4]、または酵素標識^[5]^{[6]が使用されます。}

テクノロジー

現代の光学マッピングプラットフォームは次のように機能します。^[7]

ゲノム DNA は溶解した細胞から取得され、ランダムに剪断されて、光学マッピング用の大きなゲノム分子の「ライブラリ」が生成されます。
蛍光顕微鏡下では、電荷の相互作用により、DNA 分子 1 つが引き伸ばされ (または伸長され)、スライド上で所定の位置に保持されます。
DNA 分子は、特定の消化部位で切断する制限酵素によって消化されます。結果として生じた分子の断片は表面に付着したままになります。切断部位の断片の端は引き戻され (直線化された DNA の弾性により)、顕微鏡で識別できる隙間が残ります。
インターカレーション色素で染色された DNA 断片は蛍光顕微鏡で可視化され、積分された蛍光強度を測定することでサイズが決定されます。これにより、単一分子の光学マップが作成されます。
個々の光学マップが組み合わされて、コンセンサスのゲノム光学マップが生成されます。

光学マッピングプラットフォームの歴史

初期のシステム

DNA 分子は、カバーガラスと顕微鏡スライドの間に形成された溶融アガロース上に固定されました。DNA を配置する前に、制限酵素を溶融アガロースと事前に混合し、マグネシウムの添加によって切断を誘発しました。

帯電表面の使用

DNA 分子はゲルマトリックス内に固定されるのではなく、正に帯電した表面上の静電相互作用によって所定の位置に保持されます。解像度が向上し、約 30 kb から 800 bp ほどの小さな断片までのサイズを測定できるようになりました。

自動化システム

これには、並列酵素処理のためにスライド（マイクロアレイなど）上の複数の単一分子をスポットする自動スポッティングシステム、画像取得用の自動蛍光顕微鏡、画像を処理する画像処理ビジョン、光学マップ構築用のアルゴリズム、大量のデータを処理するためのクラスターコンピューティングの開発と統合が含まれます。

マイクロ流体工学を用いた高スループットシステム

単一分子をスポットしたマイクロアレイは大きなゲノム DNA 分子にはうまく機能しないことを観察し、一連の平行マイクロチャネルを備えたソフトリソグラフィーを使用したマイクロ流体デバイスが開発されました。

ナノコーディング技術を活用した次世代システム

「ナノコーディング」と呼ばれる光学マッピングの改良^[8]は、細長いDNA分子をナノ空間に閉じ込めることでスループットを向上させる可能性があります。

比較

その他のマッピング技術

従来のマッピング技術に対するOMの利点は、DNA断片の順序が保持されることです。一方、制限マッピングでは順序を再構築する必要があります。さらに、マップはゲノムDNA分子から直接作成されるため、クローニングやPCRによるアーティファクトは回避されます。ただし、各OMプロセスは、すべての制限部位が各分子で切断されるわけではなく、一部の部位が誤って切断される可能性があるため、依然として偽陽性および偽陰性の部位の影響を受けます。実際には、同じゲノム領域の分子から複数の光学マップが作成され、アルゴリズムを使用して最適なコンセンサスマップが決定されます。^[9]

その他のゲノム解析方法

ゲノム間の大規模なゲノム変異（インデル、重複、逆位、転座など）を識別するには、さまざまなアプローチがあります。その他の方法のカテゴリには、マイクロアレイ、パルスフィールドゲル電気泳動、細胞遺伝学、ペアエンドタグの使用が含まれます。

用途

当初、光学マッピングシステムは、細菌、寄生虫、真菌の全ゲノム制限地図を作成するために使用されました。^[10]^[11]^[12]また、細菌ゲノムの足場を構築して検証するためにも使用されています。^[13]アセンブリの足場として、アセンブリされた配列コンティグは、既知の配列データを使用してコンピューター内で制限部位をスキャンし、アセンブリされたゲノム光学地図に整列させることができます。商業会社の Opgen は、微生物ゲノムの光学マッピングを提供しています。より大きな真核生物ゲノムについては、David C. Schwartz 研究室 (現在はウィスコンシン州マディソン) のみが、マウス、^[14]ヒト、^[15]イネ、^[16]トウモロコシの光学マップを作成しています。^[17]

光学的シーケンス

光学シーケンシングは、合成ごとにシーケンスを実行し、光学マッピング技術を使用する単一分子DNAシーケンシング技術です。^[18]^[19]SMRTシーケンシングなどの他の単一分子シーケンシングアプローチと同様に、この技術は、最初のサンプルを増幅してDNAの複数のコピーをシーケンスするのではなく、単一のDNA分子を分析します。合成中、蛍光色素で標識されたヌクレオチドはDNAポリメラーゼを使用して組み込まれ、蛍光顕微鏡で追跡されます。この技術は、2003年にDavid C. SchwartzとArvind Ramanathanによって最初に提案されました。

光シーケンスサイクル

以下は光学シーケンシングプロセスの各サイクルの概要である。^[20]

ステップ 1: DNA バーコーディング
細胞を溶解してゲノム DNA を放出します。これらの DNA 分子は解かれ、マイクロ流体チャネルを含む光学マッピングサーフェス上に配置され、DNA がチャネルを流れるようになります。次に、これらの分子は制限酵素によってバーコード化され、光学マッピング技術によるゲノムの位置特定が可能になります。これらのステップについては、上記の「テクノロジー」セクションを参照してください。

ステップ 2: テンプレートの切り込み
DNase I を追加して、マウントされた DNA 分子にランダムに切り込みを入れます。次に、洗浄を行って DNase I を除去します。テンプレートごとに発生する切り込みの平均数は、DNase I の濃度とインキュベーション時間によって異なります。

ステップ 3: ギャップ形成
T7 エキソヌクレアーゼが追加され、DNA 分子の切れ目を利用して 5'-3' 方向にギャップが拡張されます。T7 エキソヌクレアーゼの量は、二本鎖切断のレベルが過度に高くなるのを避けるために慎重に制御する必要があります。

ステップ 4: 蛍光色素の組み込み
DNA ポリメラーゼを使用して、蛍光色素標識ヌクレオチド (FdNTP) を各 DNA 分子に沿った複数のギャップサイトに組み込みます。各サイクル中、反応混合物には 1 種類の FdNTP が含まれており、そのヌクレオチドタイプを複数回追加できます。その後、さまざまな洗浄を実行して、組み込まれなかった fdNTP を除去し、イメージングと次の FdNTP 追加サイクルの準備を行います。

ステップ 5: イメージング
このステップでは、蛍光顕微鏡を使用して、ギャップ領域に組み込まれた蛍光色素標識ヌクレオチドの数をカウントします。

ステップ 6:
光退色蛍光色素を励起するために使用されるレーザー照射は、ここでも蛍光色素信号を破壊するために使用されます。これにより、基本的に蛍光色素カウンターがリセットされ、次のサイクルのためにカウンターが準備されます。このステップは、ヌクレオチドの蛍光色素ラベルを組み込んだ後に実際に除去しないという点で、光学シーケンシングのユニークな側面です。蛍光色素ラベルを除去しないことで、シーケンシングはより経済的になりますが、蛍光色素ラベルを連続して組み込む必要があり、ラベルのかさばりが原因で問題が発生する可能性があります。

ステップ 7: ステップ 4 ～ 6 を繰り返します。
ステップ 4 ～ 6 は、毎回異なる蛍光色素標識ヌクレオチド (FdNTP) を含む反応混合物を使用して、ステップ 4 で繰り返されます。目的の領域が配列決定されるまで、これを繰り返します。

最適化戦略

適切な DNA ポリメラーゼの選択は、塩基付加ステップの効率にとって重要であり、いくつかの基準を満たす必要があります。

連続した位置にFdNTPを効率的に組み込む能力
3'-5'エキソヌクレアーゼと校正活性の欠如により、新たに取り込まれたFdNTPの除去が防止される
誤組み込みを最小限に抑える高い忠実度
表面に取り付けられたテンプレート（光学マッピング表面など）に対する良好な活性

さらに、異なる蛍光色素に対する異なるポリメラーゼの好み、蛍光色素ヌクレオチド上のリンカーの長さ、およびバッファーの組成も、塩基付加プロセスを最適化し、連続した FdNTP 組み込みの数を最大化するために考慮すべき重要な要素です。

利点

単一分子分析
必要な DNA サンプルが最小限であるため、時間とコストのかかる増幅ステップが回避され、サンプル準備プロセスが合理化されます。

大きな DNA 分子テンプレート (~500 kb) と短い DNA 分子テンプレート (< 1kb) 次世代シーケンシング技術のほとんどは、大量の小さなシーケンス読み取りを目標としていますが、これらの小さなシーケンス読み取りにより、de novo シーケンシング作業とゲノム繰り返し領域の把握が困難になります。光学シーケンシングでは、大きな DNA 分子テンプレート (~500 kb) を使用してシーケンシングを行いますが、小さなテンプレートに比べて次のような利点があります。

これらの大きな DNA テンプレートは「DNA バーコード化」して、ゲノムの位置を自信を持って特定できます。したがって、大きなテンプレートから取得したシーケンスリードは、高い信頼度でゲノムにマッピングできます。さらに重要なのは、高反復領域からのシーケンスリードは高い信頼度で配置できるのに対し、短いリードは高反復領域でのマッピングが不確実であることです。光学マッピングやナノコーディングなどの特別なアルゴリズムとソフトウェアが開発され、単一分子バーコードを参照ゲノムに揃えています。
同じ大きなテンプレート分子からの複数のシーケンス読み取り。これらの複数のシーケンス読み取りにより、de novoアセンブリの複雑さが軽減され、ゲノム再配置領域が明確になり、「本質的にアセンブリエラーがなくなります。」^[20]
大きなDNA分子テンプレートの分子バーコーディングと配列取得により、広範かつ特異的なゲノム解析が可能になる

デメリット

単一分子 DNA シーケンシングには、現在の次世代シーケンシング技術によって提供される冗長読み取りカバレッジからの信頼性に匹敵する高いレベルの精度が必要です。
両方の鎖の同様の位置にニックがあるため、シーケンスバイ合成中にテンプレートが低くなります。
蛍光色素で標識されたヌクレオチドは、組み込み後に除去されず、また、これらのかさばる標識のために、複数の組み込みが困難な場合があります。

参考文献

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外部リンク

OpGen 光学マッピングソリューション
デイビッド・C・シュワルツ博士研究室

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