フェドバッチ培養

流加培養は、最も広い意味では、バイオテクノロジープロセスにおける操作技術として定義され、培養中に1つ以上の栄養素（基質）がバイオリアクターに供給され、生産物は実行の最後までバイオリアクター内に残ります。^{[1]この方法は、「基本培地が初期の}細胞培養をサポートし、栄養分の枯渇を防ぐためにフィード培地が追加される」 培養とも呼ばれます。 ^[2]これはセミバッチ培養 の一種でもあります。場合によっては、すべての栄養素がバイオリアクターに供給されます。流加培養の利点は、培養液中のフィード基質の濃度を任意のレベル（多くの場合、低レベル）に制御できることです。

一般的に言えば、栄養素（または栄養素群）の濃度を制御することが目的の代謝産物の収量または生産性に影響を与える場合、流加培養は従来のバッチ培養よりも優れています。

流加培養が効果的なバイオプロセスの種類は、次のようにまとめることができます。

1. 基質阻害^[1]

メタノール、エタノール、酢酸、芳香族化合物などの栄養素は、比較的低濃度であっても微生物の増殖を阻害します。これらの基質を適切に添加することで、遅延時間を短縮し、細胞増殖の阻害を大幅に軽減することができます。

2. 高い細胞密度（高細胞濃度）^[1]

バッチ培養では、例えば乾燥細胞 50～100 g/L といった非常に高い細胞濃度を達成するには、培地中の栄養素の初期濃度を高くする必要があります。このような高濃度になると、栄養素は阻害作用を持ちますが、バッチ培養で使用される通常の濃度ではそのような影響はありません。

3.グルコース効果（クラブトリー効果）^[1]

麦芽汁または糖蜜からのパン酵母の生産では、培養液中に過剰な糖分が存在すると、十分な溶存酸素（DO）があってもエタノールが生成されることが 1900 年代初頭から認識されていました。エタノールは細胞収率が低い主な原因です。グルコース濃度の存在下での好気的エタノール生成は、グルコース効果またはクラブツリー効果として知られています。この効果を軽減するために、パン酵母生産には一般に流加法が採用されています。大腸菌および枯草菌の好気性培養では、糖濃度が高いと酢酸などの有機酸（および少量の乳酸とギ酸）が副産物として生成され、これらの酸は細胞の成長を阻害し、代謝活動を悪化させる効果を示します。これらの酸の生成は細菌のクラブツリー効果と呼ばれています。

4.カタボライト抑制^[1]

微生物にグルコースなどの急速に代謝される炭素エネルギー源が供給されると、細胞内の ATP 濃度が上昇して酵素の生合成が抑制され、エネルギー源の代謝が遅くなります。この現象はカタボライト抑制として知られています。多くの酵素、特に異化経路に関与する酵素は、この抑制制御の対象となります。酵素生合成におけるカタボライト抑制を克服する強力な方法は、培養液中のグルコース濃度を低く保ち、増殖を制限して酵素生合成を抑制解除する流加培養です。ペニシリン発酵におけるペニシリウム クリソゲナムによるグルコースの遅い供給は、このカテゴリの典型的な例です。

5. 栄養要求性変異体^[1]

栄養要求性変異体（栄養要求性変異体）を使用する微生物プロセスでは、必要な栄養素を過剰に供給すると、フィードバック阻害および/または最終産物抑制により、目的の代謝産物がほとんど蓄積されずに、細胞は豊富に増殖します。しかし、生産速度は通常細胞濃度に比例するため、必要な栄養素が欠乏すると、細胞の成長と目的の代謝産物の全体的な生産が低下します。このようなバイオプロセスでは、必要な栄養素の量を制限して変異体を増殖させることで、目的の代謝産物の蓄積を最大化できます。必要な栄養素の濃度を低くして変異体を培養するには、制御された速度でバッチ培養に供給します。この技術は、栄養要求性変異体を使用した工業用アミノ酸生産でよく使用されます。一例としては、ホモセリン脱水素酵素遺伝子が欠損した、 ホモセリンまたはスレオニン/メチオニンを必要とするCorynebacterium glutamicumの変異体によるリジン生産が挙げられます。

6. 抑制プロモーターによる遺伝子の発現制御

オープンリーディングフレームの上流に抑制可能なプロモーターを持つ遺伝子の転写は、いわゆるホロリプレッサーと DNA 上のオペレーター領域の組み合わせによって抑制されます。特定の化合物が培養液中に存在する場合、細胞内の化合物 (またはその代謝物) は、アポリプレッサー (転写因子の一種) と共抑制因子として結合し、ホロリプレッサーを形成します。この化合物の濃度を可能な限り低く保つと (十分な細胞増殖が可能な範囲で)、制御された遺伝子の発現を継続できます。流加培養は、そのための強力な技術です。抑制可能なプロモーターの例には、trpプロモーターやphoAプロモーターがあります。

7. 操作時間の延長、蒸発により失われた水分の補給、培養液の粘度の低下^[1]

フェドバッチ戦略は、バイオリアクター内で高い細胞密度を達成するために、バイオ産業プロセスで典型的に使用されます。^{[3] [4] [5] [6]} ほとんどの場合、フィード溶液はバイオリアクターの希釈を避けるために高濃度です。組換え微生物のフェドバッチ培養による異種タンパク質の生産は広く研究されてきました。^{[7] [8] [9] [10]}

栄養素の制御された添加は培養物の成長速度に直接影響し、オーバーフロー代謝（大腸菌の酢酸、哺乳類細胞培養の乳酸、サッカロミセス・セレビシエのエタノール などの副代謝物の生成）や酸素制限（嫌気性）を回避するのに役立ちます。^{[11] [12]}

最も単純な流加培養は、増殖を制限する基質の供給速度が一定である、つまり培養中供給速度が不変である培養である。このケースはグラフに表示されている（ここでは培養容積は可変）。このタイプの流加培養は定常流加培養（CFBC）と呼ばれ、数学的に^{[13] 、実験的に[14]}確立されている。CFBCでは、固定容積CFBCと可変容積CFBCの両方のケースが研究された。

理想的な条件下では、細胞は指数関数的に増殖します。増殖制限基質の供給速度を細胞の指数関数的増殖速度に比例して増加させると、培養液中の基質濃度を一定に保ちながら、細胞の比増殖速度を長時間維持することができます。必要な供給速度（体積または質量）は時間とともに指数関数的に増加する必要があるため、この流加培養モードは指数関数流加培養（EFBC）と呼ばれます。^[15]

基質制限は、反応速度を制御し、反応器の冷却や酸素移動に関連する技術的制限を回避する可能性を提供します。基質制限は、浸透圧効果、異化抑制、副産物のオーバーフロー代謝を回避するための代謝制御も可能にします。^{[16] [17] [18]}

フェドバッチプロセスでの成長を制御するには、さまざまな戦略を使用できます。