シクロヘキシミド追跡

シクロヘキシミドチェイスアッセイは、分子生物学および細胞生物学で定常状態のタンパク質安定性を測定するために使用される実験技術です。シクロヘキシミドは、真核生物のタンパク質翻訳における伸長段階を阻害し、タンパク質合成を妨げる薬剤です。 ^[1]培養細胞にシクロヘキシミドを添加し、複数の時点でタンパク質を溶解することで、時間の経過に伴うタンパク質分解を観察し、タンパク質の半減期を決定することができます。これらのアッセイの後には、タンパク質の存在量を評価するウェスタンブロッティングが行われることが多く、ImageJなどの定量ツールを使用して分析できます。^[2]

実装

シクロヘキシミド チェイス アッセイは、酵母や哺乳類細胞株など、さまざまな細胞タイプを使用して行われています。^{[3] [4] [5] [6]}分析に使用する細胞システムに応じて、アッセイの適用と時間経過が異なる場合があります。たとえば、目的のタンパク質基質を発現する酵母細胞では、通常、タンパク質のターンオーバーを起こすために最長 90 分間続くシクロヘキシミド チェイスが必要です。^{[4] [7]}対照的に、哺乳類細胞株で発現されるタンパク質は定常状態でより安定する傾向があり、3 ～ 8 時間続くチェイスが必要になる場合があります。^{[4] [5] [6]}タンパク質の複雑さと、モデル システムで過剰発現しているか内因性であるかに応じて、必要なチェイスの長さは異なります。チェイス全体にわたってタンパク質合成が阻害されるようにするために、シクロヘキシミドを数時間ごとにサンプルにスパイクすることがよくあります。

酵母では、欠失株はシクロヘキシミド追跡によるタンパク質の経時的安定性の評価によく使用されます。たとえば、シャペロン、E3リガーゼ、液胞タンパク質などの重要な分解機構を欠く酵母株は、目的のタンパク質基質の分解メカニズムを決定するためによく使用されます。^{[5] [7]薬物処理（} MG132など）も分解ステップを阻害するために使用され、その後シクロヘキシミド追跡が行われ、目的のタンパク質の安定性がどのように影響を受けるかが観察されます。^{[3] [4] [7]}これらの実験は、酵母欠失株の代わりに互換性のあるノックダウン手順を実施することで、哺乳類細胞で行うことができます。^[4]

シクロヘキシミドチェイスは、さまざまな変異がタンパク質の安定性にどのように影響するかを評価するのにも役立ちます。酵母細胞と哺乳類細胞で実験が行われ、タンパク質の安定性に必要な重要な残基と、疾患に関連する変異が細胞内のタンパク質の半減期にどのように影響するかが調べられました。^{[3] [6]}この情報は、タンパク質の折り畳みの複雑さと、変異が関連する疾患の発症にどのように寄与するかを理解するために役立ちます。

利点

タンパク質の安定性を評価する他の方法と比較して、シクロヘキシミド チェイス アッセイには多くの利点があります。シクロヘキシミド チェイスは、さまざまなモデル システムで使用でき、ほぼすべてのタンパク質基質の研究に実装できます。シクロヘキシミドは他の薬剤と比較して比較的安価な化合物であり、短期間で低用量で使用すると効果的です。パルス チェイス アッセイは、シクロヘキシミド チェイス アッセイの代替方法であり、新しく翻訳されたタンパク質を放射性標識し、その後同様の「チェイス」期間を置きます。^[8]この方法は情報量が多く、新生タンパク質の豊富さを観察できるという利点がありますが、必要な放射性物質は高価で、保存期間が短く、シクロヘキシミドよりも注意して使用する必要があります。

デメリット

シクロヘキシミド チェイス アッセイを実施する際の欠点としては、シクロヘキシミドの毒性が挙げられます。高濃度で長期間使用すると、シクロヘキシミドは細胞内の DNA を損傷し、重要な細胞機能を損ないます。^[9]このため、シクロヘキシミド チェイスは通常 12 時間以上は持続しません。特に安定したタンパク質のターンオーバーを研究する場合、これは制限となります。さらに、シクロヘキシミド チェイスでは、パルス チェイスなどの新しく翻訳されたタンパク質レベルではなく、定常状態のタンパク質レベルのみを調べることができます。そのため、タンパク質の分解のみが観察され、タンパク質の成熟は観察されません。