サイトフ

飛行時間型サイトメトリー（ CyTOF ）は、質量サイトメトリーの応用であり、単一細胞の表面および内部の標識ターゲットを定量化するために使用されます。CyTOF では、ICP-MS検出器を使用して複数の細胞成分を同時に定量化できます。

CyTOF は、免疫標識を利用して細胞内のタンパク質、炭水化物、脂質を定量化します。特定の研究課題に答えるためにターゲットが選択され、ランタニド金属タグ付き抗体で標識されます。標識された細胞は噴霧され、加熱されたアルゴンガスと混合されて、粒子を含む細胞を乾燥させます。サンプルガス混合物は、アルゴンプラズマトーチで集束され、点火されます。これにより、細胞が個々の原子に分解され、イオン雲が生成されます。環境空気と生物学的分子から生成された大量の低重量イオンは、四重極質量分析器を使用して除去されます。抗体タグからの残りの重イオンは、飛行時間型質量分析法によって定量化されます。^[1]イオンの存在量は、細胞あたりのターゲットの量と相関しており、細胞の品質を推測するために使用できます。^[2]

質量分析は異なるイオンを検出する感度が高いため、蛍光プローブを使用するときに見られるスペクトルの重なりの問題を回避しながら、細胞あたり50個以上のターゲットを測定することができます。^{[3] [4]}しかし、この感度は微量重金属汚染が懸念されることを意味します。^[5]多数のプローブを使用すると、生成された高次元データの分析に新たな問題が発生します。^[6]

1994年、名古屋大学の野水勉と同僚らは、単一細胞の最初の質量分析実験を行った。野水は、単一細胞を噴霧し、乾燥させ、プラズマ中で点火してイオンの雲を生成し、それを発光分光法で検出できることを認識した。^[7]このタイプの実験では、細胞内のカルシウムなどの元素を定量化できる。フローサイトメトリーに触発されたスコット・D・タナーは、2007年にこのICP-MSを基盤として、ランタニド金属を使用してDNAと細胞表面マーカーを標識する最初のマルチプレックスアッセイを開発した。^[8] 2008年、タナーは、ICP-MS装置へのフローサイトメーターのタンデムアタッチメントと、細胞マーカーの大規模なマルチプレックス分析を可能にする新しい抗体タグについて説明した。^[9]このフローとICP-MSを組み合わせた装置の検出速度と感度をさらに最適化することで、彼らは最初のCyTOF装置を構築した。^[1]

CyTOF装置はもともとカナダのDVS Sciences社が所有していましたが、2014年に同社がDVS Sciences社を買収した後、現在はFluidigm社の独占製品となっています。2022年にFluidigm社は資本注入を受け、社名をStandard BioToolsに変更しました。^[10] CyTOF装置には、CyTOF、CyTOF2、Helios™ ^[5]、CyTOF XTという4つのバージョンがあります。^[11]連続的な改良は主に検出範囲とソフトウェアパラメータの拡大であり、Helios装置はイットリウム89からビスマス209までの金属を検出でき、スループットは毎分2000イベントの分析が可能です。

ランタニドグループの元素は、生物学的サンプルのバックグラウンドが非常に低いため、抗体のタグ付けに使用されます。 ^[12]バイオマーカーに適切な同位体を選択するときは、低発現バイオマーカーを高信号強度の同位体と組み合わせる必要があります。 ^[13]純度の低い同位体を使用する必要がある場合は、非特異的結合やバックグラウンドを最小限に抑えるために、低発現バイオマーカーと組み合わせる必要があります。

同位体ポリマーは、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）キレート剤を使用してイオンを結合して構築されます。 ^[13]ポリマーは、抗体のFc領域にある還元ジスルフィドにリンクするチオールまたはマレイミドで終了します。 ^[14] 4〜5個のポリマーが抗体に結合し、抗体あたり約100個の同位体原子になります。^[14]タグ付き抗体は、溶液中、ビーズに結合、または表面固定化される場合があります。細胞染色は、フローサイトメトリーの蛍光染色と同じ手順に従います。^[14]

生細胞と死細胞を区別するために、細胞をロジウムでプローブします。ロジウムは死細胞のみを透過する挿入剤です。その後、すべての細胞を固定し、すべての細胞を透過するイリジウムで染色して、どの細胞が生きているかを視覚化します。^[14]

質量サイトメーターの細胞導入方法は、エアロゾルスプリッター注入です。^{[13]次に、細胞は}アルゴンガスの流れに捕らえられ、プラズマに運ばれ、そこで蒸発、原子化、イオン化されます。細胞はイオンの雲となり、イオン光学センターに送られます。次に、飛行時間分析装置を使用してイオンの質量を測定します。

イオンは、分光計を通してパルス状に加速されます。1 つのセルから生成される電子雲は、通常 10 ～ 150 パルスです。Helios™ の実行の出力は、各質量チャネルのイオンから測定された電子強度を含むバイナリ統合質量データ (IMD) ファイルです。連続パルスは、1 つのセルから生成されたイオン雲に対応する個々のセル イベントに分解する必要があります。ユーザーが設定した下側畳み込みしきい値を通過する 10 ～ 150 パルスの各ビンは、Helios™ ソフトウェアによってセル イベントと見なされます。^{[1] [5]}下側畳み込みしきい値は、セル イベントと見なされるためにすべてのイオン チャネルで到達する必要がある最小イオン数です。このパラメーターの値は、測定されるイオンの数に応じて増加するため、より多くのラベルが使用される場合、セル イベントを定義するためにより多くのカウントが必要になります。^[5]  

データ解析では、IMDファイルはフローサイトメトリー標準（FCS）形式に変換されます。このファイルには、マトリックス状に配置されたすべての細胞の各チャネルの合計イオンカウントが含まれており、フローサイトメトリー中に生成されるファイルと同じです。^[5]このデータの手動ゲーティングは、フローサイトメトリーの場合と同様に実行でき、フローサイトメトリー解析に使用できるツールのほとんどはCyTOFに移植されています（フローサイトメトリーバイオインフォマティクスを参照）。^[6] CyTOFデータは、通常、高次元です。細胞集団間の関係性を描写するために、次元削減アルゴリズムがよく使用されます。いくつかの多次元解析クラスタリングアルゴリズムが一般的です。人気のあるツールには、 tSNE、FlowSOM、拡散疑似時間（DPT）などがあります。 ^[6]下流の解析方法は、研究目標によって異なります。

CyTOFは、タンパク質発現、免疫表現型、機能的特徴に関する重要な情報を単一細胞レベルで提供します。これは免疫学において貴重なツールであり、多数のパラメータがこの複雑なシステムの働きを解明するのに役立っています。^{[15] [13]}たとえば、ナチュラルキラー細胞は、さまざまな組み合わせの多数のマーカーの影響を受ける多様な特性を持っていますが、この技術が登場する前は、これを簡単に分析することはできませんでした。^[16]多くのバイオマーカーを同時に測定することで、1つの複雑な細胞群内で30を超える異なる免疫表現型サブセットを識別できます。^[15]これにより、免疫機能、感染症、がんをより完全に特徴付け、治療に対する細胞の反応を理解するのに役立ちます。

CYTOF の主な利点は、他のサイトメトリー法よりもパネルあたり多くのパラメータを調査できることです。これにより、複雑で重複する多くのパネルを必要とせずに、複雑で異質な細胞集団をより深く理解できます。パネルには最大 45 個の抗体を含めることができますが、従来のフローサイトメトリーでは 10 個しか含められませんが、設計には高度な専門知識が必要です。^[15]しかし、スペクトルフローサイトメトリーの開発により、使用できる抗体の最大数に関して、フローサイトメトリーとマスサイトメトリーのギャップは埋まりました。パネルあたりの抗体の数が増えると、時間が節約され、より広い範囲を理解できるようになり、実験あたりに必要な細胞数が少なくなります。これは、腫瘍研究など、サンプルが限られている場合に特に有利です。^[4]

重金属同位体を使用すると、蛍光抗体を使用する場合と比較してバックグラウンドも低下します。骨髄細胞などの一部の細胞タイプは自己蛍光率が高く、フローサイトメトリーで多くのバックグラウンドノイズを生成します。^[4]しかし、使用される希少な重金属同位体は生物系には存在しないため、バックグラウンドはほとんど見られないかまったく見られず、全体的な感度が向上します。^[4]異なる重金属間の検出重複も、蛍光サイトメトリーで見られる重複と比較して非常に低いため、多くのマーカーのパネルの設計がはるかに簡単になります。

蛍光染料は光退色するため、染色後数時間以内に全プロセスを完了する必要があります。一方、金属タグ付き抗体はシグナルを失うことなく最大2週間生存できるため、実験の柔軟性が高まります。染色されたサンプルは凍結保存も可能で、長期間にわたってサンプルを収集する臨床試験に特に役立ちます。^[4]

CyTOFは、金属タグ付き抗体と抗体結合キットが高価なため、コストが高くなります。CyTOFの主な欠点は、フローサイトメトリーと比較して、取得フロー速度がほぼ1桁遅いことです。^{[13] [4]}重金属は実験室の試薬によく含まれるため、サンプル調製中の汚染を避けることが非常に重要です。