Tn3トランスポゾン

Tn3トランスポゾンは、原核生物に見られる4957 塩基対の可動性遺伝要素です。3 つのタンパク質をコードします。

• β-ラクタマーゼは、 β-ラクタム系抗生物質に対する耐性を付与する酵素です（ bla遺伝子によってコードされています）。
• Tn3トランスポザーゼ（遺伝子tnpAによってコードされる）
• Tn3 リゾルバーゼ（遺伝子tnpRによってコードされる）

Tn3 は複製型トランスポゾン（コピー＆ペースト型トランスポゾン）の一例です。

当初はトランスポザーゼのリプレッサーとして発見されたリゾルバーゼは、Tn3 複製を促進する役割も果たします (Sherratt 1989)。

トランスポゾンの両側には 38bp の逆方向反復配列が配置されています。

この最初の段階はトランスポザーゼによって触媒されます。

トランスポゾンを含むプラスミド (ドナー プラスミド) は、宿主プラスミド (ターゲット プラスミド) と融合します。このプロセスで、トランスポゾンと宿主 DNA の短い部分が複製されます。最終生成物は、トランスポゾンの 2 つのコピーを含む「共統合」プラスミドです。

シャピロ（1978）^[1]は このプロセスについて次のようなメカニズムを提案した。

1. 4 回の一本鎖切断が起こります。ドナー プラスミドの各鎖に 1 回ずつ、ターゲット プラスミドの各鎖に 1 回ずつです。
2. ドナープラスミドとターゲットプラスミドは連結されますが、元の切断の位置により、2 つの一本鎖領域が存在します。
3. DNA 複製では、既存の鎖をテンプレートとして使用して、一本鎖領域を二本鎖にします。この段階でトランスポゾンが複製されます。

   

右の図は、プラスミドが融合した後、切断の位置によって特定の領域の複製がどのように行われるかを示しています。

宿主分子と標的分子を分離するために、Tn3 リゾルバーゼは、トランスポゾンの各コピーに存在するresと呼ばれる特定のサイトで、トランスポゾンの古いコピーと新しいコピーの間で部位特異的組換えを実行します。 Resは 114 bp の長さで、サイト I、II、III という 3 つのサブサイトで構成されています。 これらのサイトはそれぞれ長さが異なり (それぞれ 28、34、25bp)、サイト I と II は 22bp 離れていますが、サイト II と III の間はわずか 5bp と不均等な間隔になっています。 サイトは、可変長の中央配列を挟む 6bp の逆方向反復モチーフで構成されています。 これらのモチーフはリゾルバーゼの結合部位として機能するため、各サイトはリゾルバーゼ二量体に結合しますが、親和性は異なり、おそらくタンパク質-DNA 複合体の構造はわずかに異なります。^{[2] [3]} 3 つのサブサイトはすべて組換えに不可欠です。

組み換え時に、各サブサイトにリゾルバーゼ二量体が結合した 2 つの直接反復 res サイトが一緒になって、シナプトソームと呼ばれる大きな複合体構造を形成します。サイト II と III に結合したリゾルバーゼが、この複合体の組み立てを開始します。正確な構造はまだ不明ですが、この構造では、2 つの res サイトが絡み合ってサイト I の 2 つのコピーを並置し、各サイトに結合したリゾルバーゼ二量体がテトラマーを形成できるようにします。また、アクセサリ サイト (サイト II と III) に結合したリゾルバーゼ二量体とサイト I のリゾルバーゼとの相互作用により、2 つの二量体がシナプスを形成してテトラマーを形成します。テトラマーが形成されると、テトラマーが活性化され、上部と下部の DNA 鎖が 2bp のオーバーハングを持つサイト I の中央で同時に切断されます。まだ不明なメカニズムによって鎖交換が起こり、結果として 180° の正味回転が生じます。鎖交換の後、再連結が行われます (Stark ら、1992)。2 つの直接反復 res サイト間の組換えにより、「共統合体」が分離、つまり解消されて、それぞれに Tn3 トランスポゾンのコピーが含まれる 2 つの元の分子になります。解消後、これらの 2 つの分子は、単純な 2 ノード カテナンとして連結されたままになり、タイプ IIトポイソメラーゼによって体内で簡単に分離できます(Grindley 2002)。野生型リゾルバーゼ システムには、スーパーコイル基質が絶対に必要であり、組換えサイトは同じ DNA 分子上の直接反復に配向する必要があります。ただし、アクセサリ サイトの必要性がなくなった「調節解除」または「過剰活性」の変異体が多数分離されています。これらの変異体は、サイト I の 2 つのコピー間の組換えのみを触媒することができ、基本的に組換えサイトのサイズが 114bp から 28bp に減少します。^{[4] [5]} さらに、これらの変異体はスーパーコイルや接続性を必要とせず（Arnold et al., 1999）、哺乳類細胞で機能することが示されている。^[6]これまでのところ、高活性リゾルバーゼ変異体は、配列特異性を変化させたリゾルバーゼの作成に有用であることが証明されているが^[7]、構造研究にも有用である。^[8]

リゾルバーゼ組換え反応全体は、野生型タンパク質または過剰活性変異体のいずれかを使用して、リゾルバーゼ、基質DNA、および多価カチオンのみを使用して試験管内で再現できます。 ^{[4] [9]}

過剰活性リゾルバーゼ変異体は、さらに開発されれば、現在まで分子生物学で最も一般的に使用されている組み換えシステムである CreおよびFLPの代替となる可能性があります。

• Sherratt, DJ (1989)。Tn3 および関連する転移因子: 部位特異的組換えと転位。Berg, DE、Howe, M. (編) Mobile DNA。アメリカ微生物学会、ワシントン DC、pp. 163–184
• Grindley, NDF (2002)。Tn3 様要素の移動: 転置と共統合の解決。Mobile DNA II、Craig, N.、Craigie, R.、Gellert, M.、Lambowitz, A. (編)、pp272–302。ASM Press、ワシントン DC、米国