Phred (ソフトウェア)

Phred は、電気泳動と 4 蛍光染料法を使用する自動DNA シーケンサーによって生成された蛍光「トレース」データから核酸塩基配列を識別する、ベースコーリング用のコンピュータプログラムです。 ^{[1] [2]}最初に開発されたとき、Phred は他の方法よりも検査されたデータセットで大幅に少ないエラーを生成し、平均で 40～50% 少ないエラーを生成しました。Phred品質スコアは、DNA 配列の品質を特徴付けるものとして広く受け入れられており、さまざまなシーケンシング方法の有効性を比較するために使用できます。

蛍光色素DNA 配列決定法は、さまざまな長さの一本鎖DNA配列を 4 種類の蛍光色素 (DNA で使用される 4 種類の塩基に対応) で標識し、その後「スラブゲル」またはキャピラリー電気泳動法 ( DNA 配列決定を参照) で DNA 配列を分離する分子生物学技術です。電気泳動の実行はDNA シーケンサーのCCDによって監視され、CCD ポイントを通過した蛍光「ピーク」の時間「トレース」データ (または「クロマトグラム」) が生成されます。トレース データ内の蛍光ピークを調べると、DNA内の個々の塩基 (核酸塩基)の順序を判定できます。ただし、蛍光ピークの強度、形状、位置は常に一貫しているわけではなく、明確でもありません。そのため、手動で行うと、ピークの正しい塩基を正確に判定 (または「呼び出し」) することが困難または時間がかかる場合があります。

自動化された DNA シーケンシング技術は分子生物学 の分野に革命をもたらし、膨大な量の DNA シーケンシング データを生み出しました。しかし、シーケンシング データの生成速度は手動で処理できる速度 (つまり、トレース データを解釈してシーケンシング データを生成する) よりはるかに速いため、ボトルネックが生じます。ボトルネックを解消するには、処理速度を向上させて精度を高めることができる自動化ソフトウェアと、精度を信頼できる方法で測定できるソフトウェアの両方が必要です。このニーズを満たすために、多くのソフトウェアプログラムが開発されています。そのようなプログラムの 1 つが Phred です。

Phred は、1990 年代初頭に当時セントルイスのワシントン大学の教授であったPhil Greenによって考案されました。LaDeana Hillier、Michael Wendl、David Ficenec、Tim Gleeson、Alan Blanchard、Richard Mottもコードベースとアルゴリズムに貢献しました。Green は1990 年代半ばにワシントン大学に移り、その後は主に彼と Brent Ewing によって開発が管理されました。Phred は、大量のシーケンス データが自動化されたスクリプトによって処理されたヒトゲノム プロジェクトで重要な役割を果たしました。その高いベース コーリング精度のため、当時は学術および商業の DNA シーケンシング研究室の両方で最も広く使用されていたベース コーリング ソフトウェア プログラムでした。^{[3] Phred は CodonCode Corporation によって商業的に配布されており、プログラム}CodonCode Alignerの「ベースを呼び出す」機能を実行するために使用されます。また、MacVectorプラグイン アセンブラーでも使用されています。

Phred は、Ewing らによって概説された 4 段階の手順を使用して、処理された DNA 配列のトレースから塩基呼び出しのシーケンスを決定します。

1. 予測ピーク位置は、ゲルのほとんどの領域でフラグメントが平均して比較的均等に配置されているという仮定に基づいて決定され、ピークが十分に分離されていない、ノイズが多い、またはずれている領域（圧縮など）で正しい塩基数と理想的な均等配置の位置を決定します。
2. 観測されたピークはトレースで識別される
3. 観測されたピークは予測されたピークの位置と一致し、一部のピークは省略され、他のピークは分割されます。観測された各ピークは特定の配列から取得され、4 つの塩基 (A、G、T、または C) のうちの 1 つに関連付けられているため、一致した観測ピークの順序付きリストによってトレースの塩基配列が決定されます。
4. 一致しない観測ピークは、塩基を表しているように見えるが第 3 フェーズで予測ピークに割り当てることができなかったピークがあるかどうかチェックされ、見つかった場合は、対応する塩基が読み取りシーケンスに挿入されます。

全体の手順は迅速で、通常はトレースごとに0.5秒未満しかかかりません。結果はPHDファイルとして出力され、ベースコール、品質、位置の3つからなるベースデータが含まれます。^[4]

Phred は、DNA 配列アセンブリ用のプログラムであるPhrapという別のソフトウェア プログラムと一緒に使用されることがよくあります。Phrap は、ヒトゲノム配列決定プロジェクトのいくつかの最大規模の配列決定プロジェクトで日常的に使用されており、現在、バイオテクノロジー業界で最も広く使用されている DNA 配列アセンブリ プログラムの 1 つです。Phrap は、Phred 品質スコアを使用して、高精度のコンセンサス配列を決定し、コンセンサス配列の品質を推定します。また、Phrap は、2 つの重複する配列間の不一致がランダム エラーから発生する可能性が高いのか、それとも繰り返し配列の異なるコピーから発生する可能性が高いのかを推定するためにも Phred 品質スコアを使用します。

• Phil Green Phrap 研究所のホームページ。