リン酸化プロテオミクス

ホスホプロテオミクスは、翻訳後修飾としてリン酸基を含むタンパク質を識別、カタログ化、および特徴付けるプロテオミクスの分野です。 リン酸化は、タンパク質の機能、細胞内局在、複合体形成、タンパク質の分解、ひいては細胞シグナル伝達ネットワークを制御する重要な可逆的修飾です。これらすべての修飾結果から、全タンパク質の30～65%がリン酸化され、複数回リン酸化されるタンパク質もあると推定されています。^{[1] [2]}多くのデータセットからの統計的推定に基づくと、ヒト、マウス、酵母にはそれぞれ230,000、156,000、40,000のリン酸化部位が存在するはずです。^[2]

発現解析と比較すると、ホスホプロテオミクスは 2 つの追加情報レイヤーを提供します。まず、リン酸化状態の変化はほぼ常にタンパク質活性の変化を反映するため、活性化される可能性のあるタンパク質または経路に関する手がかりを提供します。次に、キナーゼ阻害剤グリベックに代表されるように、潜在的な薬剤ターゲットになり得るタンパク質を示します。ホスホプロテオミクスはリン酸化タンパク質の数と種類に関する知識を大幅に拡大しますが、その最大の可能性は、リン酸化に基づくシグナル伝達ネットワーク全体を迅速に解析できることです。^[3]

大規模なリン酸化プロテオーム解析のサンプルには、培養細胞にSILACエンコーディングを施す、細胞を目的因子（成長因子、ホルモンなど）で刺激する、時間的解析のために刺激をさまざまな時間にわたって行う、細胞を溶解して酵素消化する、イオン交換クロマトグラフィーを使用してペプチドを分離する、リン酸化ペプチドをリン酸化特異的抗体、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーまたは二酸化チタン（TiO ₂）クロマトグラフィーを使用して濃縮する、リン酸化ペプチドを質量分析法を使用して分析する、そしてペプチドを配列決定して分析する、という手順が含まれます。^[4]

細胞内のリン酸化タンパク質の完全な分析は、確かに実現可能な選択肢です。これは、リン酸化タンパク質とリン酸化ペプチドの濃縮プロトコルの最適化、クロマトグラフィーを使用したより優れた分画技術、および質量分析法を使用したリン酸化残基を選択的に視覚化する手法の改善によるものです。リン酸化プロテオーム分析の現在の手順は大幅に改善されていますが、サンプルの準備、濃縮、および機器に関して、サンプルの損失や不一致がまだあります。バイオインフォマティクスツールと生物学的配列データベースも、ハイスループットリン酸化プロテオーム研究に必要です。^[5]

リン酸化タンパク質を単離する従来の手順には、³² P 標識ATPによる放射性標識とそれに続く SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動または薄層クロマトグラフィーが含まれていました。これらの従来の方法は、リン酸化分析に必要な大量のタンパク質を得ることができないため、非効率的です。したがって、リン酸化タンパク質を濃縮する現在の最も簡単な方法は、リン酸化特異的抗体、固定化金属親和性クロマトグラフィー (IMAC)、強陽イオン交換 (SCX) クロマトグラフィー、または二酸化チタンクロマトグラフィーを使用したアフィニティー精製です。抗リン酸化チロシン抗体は精製に非常に効果的であることが証明されていますが、ホスホセリンまたはホスホトレオニンを含むタンパク質に対する抗体を使用した報告は少ないです。IMAC 濃縮は、樹脂に固定化されたキレート化金属に対するリン酸親和性に基づいています。SCX は、負に帯電したリン酸基に基づいて、リン酸化ペプチドと非リン酸化ペプチドを分離します。二酸化チタンクロマトグラフィーは、カラムの準備時間が大幅に短い新しい技術です。多くのリン酸化プロテオミクス研究では、これらの濃縮戦略を組み合わせて、可能な限り純粋なサンプルを取得します。

質量分析は現在、タンパク質サンプルのペアを適切に比較する最良の方法です。このタスクを実行するための 2 つの主な手順は、同位体コード化アフィニティ タグ(ICAT) と細胞培養における安定同位体アミノ酸 (SILAC) の使用です。ICAT 手順では、サンプルは分離後にシステイン残基を修飾する質量コード化試薬で個別にラベル付けされます。SILAC では、細胞は異なる同位体標識アミノ酸の存在下で数回の細胞分裂の間別々に培養され、細胞タンパク質がラベルを取り込むことができます。その後、質量分析を使用して、ホスホセリン、ホスホトレオニン、およびホスホチロシンを含むペプチドを識別します。^[6]

細胞内シグナル伝達は、主にキナーゼと呼ばれる酵素によるさまざまなシグナル伝達分子の可逆的なリン酸化によって媒介されます。キナーゼは、 ATPからリン酸基を標的分子の特定のセリン、スレオニン、またはチロシン残基に転移します。結果として生じるリン酸化タンパク質は、活性レベル、細胞内局在、または三次構造が変化する場合があります。

リン酸化プロテオミクス解析は、シグナル伝達ネットワークのダイナミクスの研究に最適です。ある研究デザインでは、細胞を SILAC 標識にさらし、特定の成長因子で刺激します。細胞はさまざまな時点で収集され、溶解液はタンデム MS による分析のために組み合わせられます。^[4] これにより、実験者は細胞内の多くのリン酸化タンパク質のリン酸化状態を経時的に追跡できます。さまざまな時点で多くのタンパク質の全体的なリン酸化状態を測定できるため、このアプローチはシグナル伝達ネットワークの挙動を分析するための従来の生化学的方法よりもはるかに強力です。^[7]

ある研究では、刺激を受けていない細胞とエフリンB1刺激を受けた細胞の間で、127のタンパク質のリン酸化状態の変化を同時に測定することができました。^[8] これらの127のタンパク質のうち、40はエフリンB1による刺激でリン酸化が増加しました。研究者らは、この情報を以前に発表されたデータと組み合わせて、EphB2受容体の下流のタンパク質のシグナル伝達ネットワークを構築することができました。

最近の別のリン酸化プロテオーム研究では、腎臓集合管における抗利尿ホルモンバソプレシンによって引き起こされるリン酸化イベントの大規模な同定と定量化が含まれていました。^[9] 223のユニークなリン酸化タンパク質上の合計714のリン酸化部位が同定され、その中にはバソプレシン感受性水チャネルアクアポリン2（AQP2）の3つの新しいリン酸化部位が含まれていました。

リン酸化プロテオミクスの誕生以来、がん研究は腫瘍の発達中にリン酸化プロテオームに生じる変化に焦点が当てられてきました。リン酸化タンパク質は、がんの診断や治療に役立つがんマーカーとなる可能性があります。実際、研究では、乳がんと肝臓がんには異なるリン酸化チロシンプロテオームがあることがわかっています。また、乳がんのチロシン残基の過剰リン酸化の証拠もありますが、正常組織には見られません。このような発見は、腫瘍リン酸化プロテオームから潜在的なバイオマーカーを探索できる可能性を示唆しています。

さまざまな腫瘍に特徴的なリン酸化タンパク質が存在し、リン酸化プロファイリングがさまざまな起源の癌のフィンガープリントとして使用できることを示唆するデータが増えています。さらに、個々の患者の腫瘍特異的リン酸化タンパク質を体系的にカタログ化することで、癌形成中に複​​数の原因因子が明らかになる可能性があります。この実験データを薬物反応や疾患の結果などの臨床データと相関させることで、診断、予後、薬物反応の予測、および潜在的な薬物ターゲットのための潜在的な癌マーカーを特定できます。^[3]

リン酸化プロテオミクスにより、リン酸化タンパク質の数と種類、およびシグナル伝達ネットワークにおける役割に関する知識が大幅に拡大しましたが、これらの技術にはまだいくつかの制限があります。まず、抗リン酸化チロシン抗体などの分離方法では、チロシンリン酸化タンパク質とチロシンリン酸化タンパク質に関連するタンパク質を区別して分離しません。したがって、リン酸化依存性タンパク質間相互作用が非常に重要であるにもかかわらず、この方法で検出されたタンパク質は必ずしもチロシンキナーゼの直接の基質ではないことを覚えておくことが重要です。免疫沈降の前にサンプルを消化することによってのみ、リン酸化タンパク質のみの分離と個々のリン酸化部位の時間的プロファイルを作成できます。もう 1 つの制限は、抽出条件がすべて網羅的ではないため、一部の関連タンパク質が見逃される可能性が高いことです。リン酸化の化学量論が低い、非常に少量である、または急速な分解のターゲットとしてリン酸化されているタンパク質が失われる可能性があります。^[10]低スループットのリン酸化データと高スループットのリン酸化プロテオミクスデータ（主にMS/MSに基づく）を組み合わせたバイオインフォマティクス解析では、現在の高スループットプロトコルは、数回の繰り返しで総リン酸化タンパク質の70％から95％を捕捉できるが、総リン酸化部位の40％から60％しか捕捉できないと推定されています。^[2]

• グリコプロテオミクス

• フォシダリン酸化部位データベース
• シグナル伝達の分析 YouTube ビデオ
• CDPD集合管リン酸化タンパク質データベース