末端配列プロファイリング

エンドシーケンスプロファイリング (ESP) (「ペアエンドマッピング (PEM)」と呼ばれることもあります) は、高解像度のコピー数および構造異常 (逆位や転座など) を識別するための de novo ゲノムシーケンスを容易にするために開発された、シーケンスタグ付きコネクタに基づく方法です。

簡単に言うと、ターゲットゲノム DNA を分離し、制限酵素で部分的に大きな断片に分解します。サイズ分画後、断片をプラスミドにクローン化して、細菌人工染色体(BAC) などの人工染色体を構築し、その後、配列を決定して参照ゲノムと比較します。構築された染色体と参照ゲノム間の方向や長さの変動などの違いから、コピー数と構造異常が示唆されます。

ESP でターゲットゲノムの構造異常やコピー数変異 (CNV) を解析する前に、ターゲットゲノムは通常、人工染色体構築によって増幅され、保存されます。人工染色体を構築するための古典的な戦略は、細菌人工染色体(BAC) です。基本的に、ターゲット染色体はランダムに消化され、細菌で形質転換されクローン化されたプラスミドに挿入されます。^[1]挿入される断片のサイズは 150～350 kb です。^[2]よく使用される別の人工染色体はフォスミドです。BAC とフォスミドの違いは、挿入される DNA のサイズです。フォスミドは 40 kb の DNA 断片しか保持できないため、^[3]より正確なブレークポイントの決定が可能になります。

末端配列プロファイリング（ESP）は、挿入、欠失、染色体再配置などの構造変異を検出するために使用できます。染色体異常を調べる他の方法と比較して、ESPは、コピー数変異を調べるときには明らかではない逆位や転座などのコピー中立異常を特定するのに特に役立ちます。^{[4] [5]} BACライブラリから、挿入された断片の両端をシーケンシングプラットフォームを使用してシーケンスします。次に、シーケンスされたリードを参照ゲノムにマッピングすることで、変異を検出します。

逆位と転座は、無効な配列末端のペアによって比較的簡単に検出できます。たとえば、ペアエンドが参照ゲノム上の異なる染色体にマッピングされている場合、転座を検出できます。^{[4] [5]}逆位は、挿入に2つのプラス端または2つのマイナス端がある場合、読み取りの方向が異なることによって検出できます。

挿入または欠失の場合、ペアエンドのマッピングは参照ゲノムと一致します。しかし、リードは見かけのサイズが一致しません。見かけのサイズは、参照ゲノムにマッピングされた BAC 配列末端の距離です。BAC に長さ (l) の挿入がある場合、一致マッピングでは参照ゲノムにサイズ (l) の断片が表示されます。ペアエンドが距離 (l) よりも近い場合、サンプル DNA に挿入が疑われます。挿入を検出するためのカットオフとして、距離 (l< μ-3σ) を使用できます。ここで、μ は挿入の平均長さ、σ は標準偏差です。^{[5] [6]}欠失の場合、ペアエンドは参照ゲノムで予想される距離 (l> μ-3σ) よりも遠くにマッピングされます。^[6]

場合によっては、不一致な読み取りが、たとえば配列の繰り返しにおけるCNV を示していることもあります。CNV が大きい場合、読み取りの密度はコピー数に応じて変化します。コピー数の増加は、参照ゲノム上の同じ領域のマッピングの増加に反映されます。

ESP は、2003 年にカリフォルニア大学サンフランシスコ校のコリンズ博士とその同僚によって初めて開発され、発表されました。彼らの研究では、MCF7 ヒト癌細胞の染色体再編成と CNV が 150kb の解像度で明らかにされました。これは、当時の CGH とスペクトル核型分析の両方と比較してはるかに正確です。^[5] 2007 年に、スナイダー博士とそのグループは、BAC 構築なしで 3kb DNA フラグメントの両方のペアをシーケンスすることにより、ESP を 3kb の解像度に改善しました。彼らのアプローチは、平均ブレークポイント解像度 644bp で欠失、逆位、挿入を識別でき、これはポリメラーゼ連鎖反応(PCR) の解像度に近いです。^[7]

エンドシーケンスプロファイリングの解析には、さまざまなバイオインフォマティクスツールを使用できます。一般的なツールとしては、BreakDancer、PEMer、Variation Hunter、common LAW、GASV、Spanner などがあります。^[8] ESP を使用すると、疾患組織の構造変異を高解像度でマッピングできます。この手法は、主にさまざまながん種の腫瘍サンプルに使用されます。転座により、腫瘍に見られる融合タンパク質、キメラタンパク質、または誤調節タンパク質が発生する可能性があるため、コピー中立染色体異常を正確に特定することが特に重要です。この手法は、異なる集団間の大きな構造変異を特定することで、進化研究にも使用できます。^[9]同様の方法がさまざまなアプリケーション向けに開発されています。たとえば、バーコード付き Illumina ペアエンドシーケンス (BIPES) アプローチを使用して、16S V6 タグをシーケンスすることで微生物の多様性を評価しました。^[10]

ESP による構造変異検出の解像度は PCR と同レベルにまで向上しており、より均一なサイズの DNA 断片を選択することでさらに向上させることができます。ESP は、構築された人工染色体の有無にかかわらず適用できます。BAC を使用すると、貴重なサンプルを不死化して保存できます。これは、大規模な分析が予定されている少量のサンプルにとって特に重要です。さらに、再配置された DNA 断片を含む BAC は、in vitroまたはin vivo で直接トランスフェクトして、これらの配置の機能を分析できます。ただし、BAC の構築は依然として高価で、手間がかかります。研究者は、特定のプロジェクトに必要な戦略を慎重に選択する必要があります。ESP は短いペアエンド配列のみを調べるため、大規模なシーケンシングを必要とせずにゲノム全体の有用な情報を提供できるという利点があります。ゲノム全体をシーケンシングする場合と比較すると、約 100 ～ 200 個の腫瘍を 150kb を超える解像度でシーケンシングできます。

• 染色体異常
• 染色体逆位
• 挿入（遺伝学）
• 欠失（遺伝学）
• 染色体転座
• 染色体異常
• コピー数変異