共局在

蛍光顕微鏡法では、共局在とは、それぞれ異なる発光波長を持つ 2 つ (またはそれ以上) の異なる蛍光標識間の空間的な重なりを観察することを指し、異なる「ターゲット」が細胞の同じ領域にあるか、または互いに非常に近い位置にあるかを確認します。定義は、2 つの異なる現象に分けることができます。共起は、同じピクセルに 2 つの (おそらく無関係の)蛍光体が存在することを指し、相関は、生物学的相互作用を示す蛍光体間のより重要な統計的関係を指します。^[1]この手法は、生体分子のペア間の関係を実証する際に、多くの細胞生物学および生理学の研究で重要です。

一対の生体分子間の相関関係を示す能力は、アムステルダム大学のエリック・マンダースによって大きく向上しました。彼は顕微鏡学者にピアソンの相関係数(PCC) ^[2]を導入しました。他の係数とともに、その中で「重複係数」M1 と M2 が最も人気があり有用であることが証明されました。^{[3] [4]}係数を使用する目的は、画像 (通常は異なる発光波長で記録された多次元顕微鏡画像の 2 つのチャネル) 間の重複の程度を特徴付けることです。人気のアプローチはシルヴァン・コステスによって導入されました。彼はピアソンの相関係数を、客観的な方法で M1 と M2 に必要なしきい値を設定するツールとして使用しました。^[5]コステスのアプローチは、正の相関関係のみが重要であるという仮定に基づいており、PCC の有用な測定を提供しません。

係数の使用により共局在検出の信頼性が大幅に向上しますが、蛍光サンプルの準備方法や共局在画像を取得して処理する方法などの条件を含む多くの要因に依存します。研究は細心の注意を払って、背景を注意深く読んだ上で実施する必要があります。現在、この分野は混乱に悩まされており、標準化されたアプローチはまだ確立されていません。^[6]これを修正する試みには、一部の係数の再検討と改訂、^{[7] [8]}ノイズを補正するための係数の適用、^[1] 「共局在の正確な測定のためのノイズ補正相関に基づく複製」^[9]およびさらなるプロトコルの提案^[10]があり、これらは Bolte と Cordelieres (2006) によって徹底的にレビューされました。^[6]さらに、蛍光画像には一定量の焦点外信号、ポアソンショット、およびその他のノイズが含まれる傾向があるため、通常は定量化の前に前処理が必要です。^{[11] [12]}デコンボリューションによる慎重な画像修復により、ノイズが除去され、画像のコントラストが高まり、共局在解析結果の品質が向上します。現在まで、共局在を定量化するために最も頻繁に使用されている方法は、2つの異なる顕微鏡チャネルのピクセル強度の統計的相関を計算します。最近の研究では、異なる細胞区画に存在することがわかっているターゲットであっても、これにより高い相関係数が得られる可能性があることが示されています。^[13]デジタルオブジェクト認識、領域の重複の計算、ピクセル強度相関値との組み合わせを組み合わせることで、共局在のより堅牢な定量化を実現できます。これにより、オブジェクト補正ピアソンの相関係数の概念が生まれました。^[13]

いくつかの不浸透性蛍光亜鉛染料は、検査した4つの異なる組織タイプのそれぞれにおいて、アポトーシス細胞および壊死細胞の細胞質および核を検出可能に標識することができる。すなわち、大脳皮質、海馬、小脳であり、また、亜鉛増加と広く認められている細胞死指標であるヨウ化プロピジウムの共局在検出が腎臓細胞でも起こることが実証された。蛍光共局在の原理を用いて、複数の細胞タイプにおける亜鉛蓄積とヨウ化プロピジウム（従来の細胞死指標）の取り込みの同時検出が実証された。^[14]神経科学分野における共局在の定量化のさまざまな例がレビューで見ることができる。^[15]共局在の定量化に関する詳細なプロトコルは、本の章で見ることができる。^[16]

共局在は、蛍光標識された分子種間の相互作用を検出するために、リアルタイムの単一分子蛍光顕微鏡で使用されます。この場合、1 つの種 (例: DNA 分子) は通常、イメージング サーフェス上に固定され、もう 1 つの種 (例: DNA 結合タンパク質) は溶液に供給されます。2 つの種は、シアニン 3 やシアニン 5 などのスペクトル分解された (>50 nm) 色の染料で標識されます。蛍光励起は通常、全反射モードで実行され、バルク溶液内の分子と比較して表面の分子の信号対雑音比が向上します。分子は、リアルタイムで表面に現れるスポットとして検出され、ポイント スプレッド関数のフィッティングによって 10 ～ 20 nm 以内の位置が特定されます。生体分子の一般的なサイズは 10 nm 程度であるため、この精度は通常、分子相互作用の検出に十分です^[17]

質的および量的共局在研究の結果をより良く解釈するために、共局在係数の値に関連付けられた5つの言語変数のセット（非常に弱い、弱い、中程度、強い、非常に強いなど）を使用してそれらを記述することが提案されました。このアプローチは、ファジーシステムモデルとコンピューターシミュレーションの使用に基づいています。新しい係数が導入されると、その値をセットに適合させることができます。^[18]

• フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）：10 nm近接
  • （光学顕微鏡：解像度は250nmのみ、有効な相互作用は不明）
• 免疫沈降（IP）ドロップダウン/プルダウン
• 酵母 2 ハイブリッド - タンパク質相互作用マッピング

蛍光顕微鏡画像における共局在の程度は、共局在の値が事前定義されたダウンロード可能な画像セットの無料コレクションで あるColocalization Benchmark Source を使用して検証できます。

• FIJI は ImageJ です - バッテリー付属
• バイオイメージXD

• AxioVision 共局在モジュール
• 共局在研究ソフトウェア
• コローカライザープロ コローカライザープロ
• ニコンのNIS-Elements共局在モジュール
• Scientific Volume Imaging の Huygens 共局在分析装置
• Quorum TechnologyのVolocity
• メディアサイバネティクスのImage-Pro
• ビットプレーンのイマリス
• アリビスVision4D
• ^[19]