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CRISPR関連トランスポゾンまたはCASTは、最小限のCRISPRシステムを利用してRNA誘導によるDNA転位を行うように進化した可動性遺伝要素（MGE ）です。 [1]標的DNAを分解する干渉機構を含む従来のCRISPRシステムとは異なり、CASTにはDNA切断を担うタンパク質やタンパク質ドメインがありません。[2]十分に特徴付けられたTn7トランスポゾンのものと類似した特殊なトランスポゾン機構が、CRISPR RNA（crRNA）および関連するCasタンパク質と複合して転位を行います。[1] CASTシステムは、さまざまな細菌で特徴付けられており、タイプIF、タイプIB、タイプIC、タイプID、タイプIE、タイプIV、タイプVKなどのさまざまなCRISPR構成を利用しています。[1] [2] [3] [4] MGEは水平遺伝子伝達による遺伝子交換の重要な部分であり、CASTは抗生物質耐性と抗ウイルス防御機構、および中心炭素代謝に関与する遺伝子の交換に関与している。[5] [6]これらのシステムは、プログラム可能性、PAMの柔軟性、および宿主修復機構の活性化を必要とする二重鎖切断なしで宿主ゲノムに直接挿入できることから、遺伝子工学に有望である。[3] [7] また、Cas1およびCas2タンパク質が欠如しているため、トランスでのスペーサー取得には他のより完全なCRISPRシステムに依存している。[2] [3]
自然の構造と機能
CRISPR関連トランスポゾンは、カットアンドペースト機構で機能するTn7トランスポゾンに類似している。[1]これは、TnsAおよびTnsBタンパク質からなるヘテロマートランスポザーゼと、調節タンパク質TnsCを含む。[1]構造解析により、トランスポゾンの末端にTnsBタンパク質と配列特異的モチーフが結合し、切除と可動性を可能にすることが示された。[8]統合の標的化は、それぞれ宿主染色体または可動要素（プラスミドまたはバクテリオファージ）内の安全な部位を優先的に標的とするTnsDまたはTnsEタンパク質によって行われる。[1] TnsEはCASTには見つからないが、TnsDホモログであるTniQが存在し、トランスポザーゼとCRISPR-Casの間のギャップを埋める働きをする。[9]複数のCRISPRタイプがトランスポゾンと関連することがわかっており、最も研究されている2つは、マルチサブユニットエフェクター（Cascade）を使用するタイプIFと、単一のCas12kエフェクターを使用するタイプVKです。[3] [7]どちらの場合も、Tn7トランスポゾンはこれらのエフェクターを利用して、部位特異的な統合のためのRループを作成するように進化しました。[3] TnsAはタイプIFシステムに存在するが、初期の特性評価中に高いオフターゲット統合を示したタイプVKシステムには存在しないことが顕著です。[3] [10]
タイプIF-3
タイプ IF-3 CAST (Tn6677) は、コレラ菌で最初に特定され、広範囲に研究されてきました。[7]このシステムには、TniQ との相互作用を介して Cas6、Cas7、および Cas5-Cas8 融合と複合体を形成するタンパク質 TnsA、TnsB、および TnsC が含まれています。[9]最初の統合ステップには、ターゲット サイトへの TniQ-Cascade の結合、およびトランスポゾンの TnsA および TnsB による切除が含まれ、その後に TnsC が TniQ に結合し、トランスポザーゼが TnsC に結合します。[9]この最終ステップの前にオフターゲットが発生する可能性がありますが、TnsB と TnsC が結合すると、最終的な校正ステップが実行され、高いオンターゲット パーセンテージが維持されます。[11] Tn6677 の統合は、宿主ゲノムの複数のポイントのサイト固有の場所でほぼ 100% のオンターゲット効率で検証されています。[7]このクラスでは、効率の範囲が様々な他のシステムも特徴付けられ、検証されており、最大10kbの多重挿入のための直交システムも含まれています。[6] [12]
タイプ IF-3 システムのユニークな特徴は、宿主染色体を標的とするために使用される自己標的ガイド RNA の存在です。これらのシステムは、非定型 crRNA を使用して対応するスペーサーをプライベート化しており、内因性のタイプ 1F システムがガイドとその干渉メカニズムを使用して宿主を分解するのを防ぎます。[13]もう 1 つのプライベート化メカニズムは、ミスマッチ許容度の使用です。これにより、CAST システムのみがスペーサーと完全に一致しないゲノム内の場所をターゲットにすることができます。[13]
タイプVK
タイプ VK システムは、もともとシアノバクテリアのScytonema hofmanni から特徴付けられ、tracrRNAと連動して機能する単一の Cas エフェクター Cas12k が含まれています。[3]このシステムは Tn7 と同様に機能しますが、過剰発現中にオフターゲティングやキメラ形成を引き起こす可能性のある TnsA タンパク質がありません。[10] Cas12k と tracrRNA の複合体はターゲット部位に結合し、TnsC は TniQ の付着と TnsB の認識および統合の前に直接隣接して重合されます。[14]これらのシステムは、タイプ II CRISPR システムの従来の tracrRNA 特性を使用しますが、トランスポゾン末端に隣接する短い crRNA をターゲットにすることもできます。[15]タイプ VK スペーサーは tRNA 遺伝子の近くの場所を優先的にターゲットしますが、これらの短い crRNA ガイドには、非伝統的な手段で取得された他のサイトが観察されています。[15]
遺伝子工学への応用
CRISPR関連トランスポゾンは、さまざまなターゲット、さまざまな宿主、さまざまなペイロードでのin vitroおよびin vivo遺伝子編集に利用されています。コレラ菌由来のTn6677システムのすべてのCASTコンポーネントは、単一のプラスミドに統合され、最大10kbのトランスポゾンをほぼ100％の効率で送達できることが確認されています。[16]これは、コミュニティの状況でも、自殺ベクターの接合送達によって、抗生物質耐性または代謝機能の強化を単一の微生物にのみ提供することが示されています。[17]これらのシステムの初期の特性評価の多くは大腸菌で行われていますが、ベータプロテオバクテリアとガンマプロテオバクテリアでは高い効率で、アルファプロテオバクテリアではやや低い効率で機能が確認されています。[18]単一のプラスミドTn677は、ヒトHEK293T細胞でも機能することが示されており、将来的には治療に使用できる可能性があります。[19]
参考文献
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