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時間分解結晶構造解析では、 X線結晶構造解析画像を利用して、反応を4次元（x、y、z、時間）で視覚化します。これにより、例えば酵素の触媒作用中に起こる動的変化の研究が可能になります。時間次元は、X線照射前に結晶内で目的の反応を誘発し、異なる時間遅延で回折パターンを収集することによって組み込まれます。高分子のこれらの動的特性を研究するには、3つの基準を満たす必要があります。[1]
- 高分子は結晶状態で生物学的に活性でなければならない
- 結晶内で反応を誘発することが可能でなければならない
- 対象となる中間体は検出可能でなければなりません。つまり、結晶中に適切な濃度（できれば 25% 以上）がなければなりません。
これにより、ポンププローブ法と拡散トラッピング法の 2 つのグループに分けられるいくつかの技術が開発されました。
ポンププローブ
ポンプ プローブ法では、反応は最初に光分解(ほとんどの場合レーザー光) によって誘発され (ポンプ)、次に特定の時間遅延で X 線パルス (プローブ) によって回折パターンが収集されます。これにより、反応誘発後にさまざまな時間遅延で多数の画像を取得でき、それによって反応中のイベントを説明する時系列の画像を構築できます。妥当な信号対雑音比を得るには、このポンプ プローブ サイクルを結晶の各空間回転ごとに何度も実行し、同じ時間遅延で何度も実行する必要があります。したがって、ポンプ プローブで研究したい反応は、誘発後に元の構造に緩和して、同じサンプルで多数の測定を行える必要があります。観察される現象の時間分解能は、プローブ パルスの時間幅 (最大値の半分の全幅) によって決まります。それよりも速い時間スケールで発生するすべてのプロセスは、プローブ パルスの強度とサンプルの実際の X 線反射率の強度との畳み込みによって平均化されます。
拡散トラッピング
拡散トラッピング法では、拡散技術を利用して基質を結晶内に導入し、その後、回折パターンを収集する前に、さまざまなトラッピング技術を適用して、目的の中間体を結晶内に蓄積させます。これらのトラッピング法には、 pHの変更[2]、阻害剤の使用[3]、または温度の低下による回転速度の遅延、または特定の段階での反応の完全な停止などが含まれます。反応を開始してから急速冷凍し[4]、特定の時間ステップで反応を停止する方法も考えられます。拡散トラッピング法の欠点の1つは、トラッピングできる中間体の研究にしか使用できないため、ポンププローブ法と比較して、この方法で得られる時間分解能が制限されることです。
参照
参考文献
- ^ Hajdu, J; Neutze, R; Sjögren, T; Edman, K; Szöke, A; Wilmouth, RC; Wilmot, CM (2000). 「4次元でのタンパク質機能の解析」Nature Structural Biology . 7 (11): 1006–12. doi :10.1038/80911. PMID 11062553. S2CID 2264560.
- ^ 山下敦子;遠藤正治；東 常之;中津 亨山田康之；小田純一;加藤宏明（2003）． 「反応開始前の酵素構造の捕捉: トロピノンレダクターゼ II − 基質複合体‡」。生化学。42 (19): 5566–73。土井：10.1021/bi0272712。PMID 12741812。
- ^ Miller, MT; Bachmann, BO; Townsend, CA; Rosenzweig, AC (2002). 「X線結晶構造スナップショットで観察されたβ-ラクタム合成酵素の触媒サイクル」。米国科学アカデミー紀要。99 ( 23): 14752–7。Bibcode : 2002PNAS ... 9914752M。doi : 10.1073/ pnas.232361199。PMC 137491。PMID 12409610。
- ^ Fiedler, E.; Thorell, S; Sandalova, T; Golbik, R; König, S; Schneider, G (2002). 「酵素チアミン触媒の重要な中間体のスナップショット：サッカロミセス・セレビシエ由来のトランスケトラーゼの活性部位における（α,β-ジヒドロキシエチル）チアミン二リン酸のα-カルバニオンの結晶構造」。 米国科学アカデミー紀要。99 ( 2): 591–5。Bibcode :2002PNAS... 99..591F。doi : 10.1073 / pnas.022510999。PMC 117350。PMID 11773632。