競合的アレル特異的PCR

競合的アレル特異的 PCR ( KASP ) は、ポリメラーゼ連鎖反応の均一な蛍光ベースの遺伝子型判定法です。シグナル生成には、アレル特異的オリゴ伸長と蛍光共鳴エネルギー移動をベースとしています。

一塩基多型（SNP）は、DNA配列内の単一のヌクレオチドが同じ種のメンバー間または対になった染色体間で異なる場合に発生します。SNPは、疾患に関連する遺伝子の位置を特定するのに役立つ分子マーカーとして機能し、遺伝子型の配列決定に使用されます。^[1]

SNPを使用した次世代シーケンシングによるジェノタイピングは高価で時間がかかり、一部のデータが欠落しています。スループット、データターンアラウンドタイム、使いやすさ、パフォーマンス（感度、信頼性、再現性、精度）、柔軟性、要件、コストを考慮した研究目的に応じて使用できるSNP技術は他にも多数あります。大規模研究で最高のスループットを得るには、マルチプレックスチップベースの技術を選択するのが最適です。マルチプレックス技術は1回の実行で100から100万を超えるSNPを生成しますが、SNPの数が少ない場合や中程度の場合には経済的ではありません。^[2] SNPの数が少ない場合は、KASPなどのユニプレックスアッセイを使用できます。

KASP アッセイには、1) 精製された DNA サンプル、2) 2 つの対立遺伝子特異的フォワードプライマー、3) 共通リバースプライマーという 3 つの要素が重要です。この方法が正しく機能するには、抽出された DNA サンプルが最低 5～10 ng 必要です。DNA サンプルは、緩衝液に化学物質の混合物を加えることで精製されます。^[2] PCR の最初のラウンドでは、2 つの対立遺伝子特異的フォワードプライマーと 1 つのリバースプライマーを含む KASP プライマーミックスが混合物に追加されます。フォワードプライマーの特殊な性質により、プライマーは対象の SNP にのみ結合し、DNA ポリメラーゼが残りの相補ヌクレオチドを配置できるようになります。この間、共通リバースプライマーが DNA の反対鎖に相補ヌクレオチドを配置し始めます。これで PCR の最初のラウンドが終了します。^[2]

PCR の 2 回目のラウンドでは、共通のリバースプライマーが PCR の 1 回目のラウンドで形成されたアンプリコンに結合すると、対立遺伝子特異的フォワードプライマーの相補鎖が生成されます。最後に、 PCR 反応の熱サイクルが継続され、KASP 法の 3 番目の部分が開始されます。蛍光標識プライマーがマスター ミックスに存在し、末端にクエンチャーを持つ相補部分とのハイブリダイゼーションにより消光されます。蛍光標識プライマーは、対立遺伝子特異的フォワードプライマーのテール シーケンスを補完し、伸長を可能にします。これは、熱サイクル設定全体で複数回発生し、増幅プロセスで使用される蛍光プライマーが増えるほど、蛍光シグナルが強くなります。通常使用される蛍光タグは、FAM と HEX です^[3]

KASP 法はマルチプレックス法よりも費用対効果が高く、1 回の検査あたり 50 ドルに対して 15 ドルです。また、KASP 法では他のマルチプレックス法よりも結果を受け取るまでの時間がはるかに短く、1 週間に対して 24 時間です。さらに、遺伝子型判定のエラー率は 0.7 ～ 1.6% と低くなっています。KASP 法は、少数のサンプルに多数の SNP がある場合や、多数のサンプルに少数の SNP がある場合に使用できるという点で、他の方法よりも柔軟性があります。ただし、マルチプレックス法は現在、SNP 遺伝子型判定の最もハイスループットなプラットフォームです。^[2]

この技術は、品質管理 (QC) ジェノタイピング、量的形質遺伝子座(QTL) マッピング、マーカー支援選択(MAS)、および対立遺伝子マイニングにおいて多くの用途があります。たとえば、KASP プラットフォームはトウモロコシの定性的管理分析に使用されています。トウモロコシでは、栽培者が選択した作物を栽培する上で均質性が重要です。対立遺伝子頻度のわずかな変動が作物の品質に大きな影響を与える可能性があり、花粉や種子の交差汚染や種子再生など、さまざまな方法で発生する可能性があります。サンプルが親世代と F1 世代の作物から採取されている限り、対立遺伝子頻度の変化が予想されるさまざまなイベントで QC 分析を使用できます。これにより、2 世代間で対立遺伝子頻度が大きく変化していないことが保証され、トウモロコシに設定された SNP に基づいてラインの純度が保証されます。トウモロコシの場合、この種の分析に使用できるSNPが50～100個特定されています。^[2]

品質分析 (QC 分析) は、近交系の純度を維持するために使用されます。QC 遺伝子型プロトコルでは、50 ～ 100 個の SNP を使用してサンプル内の非均質性を判断し、遺伝的同一性を確立します。QC は、繁殖中いつでも使用できます。

QC を集団のマッピングに使用する場合、親以外の対立遺伝子は破棄され、親間で 90% を超える SNP が多型である対立遺伝子は保持されます。

QTL マッピングは、対象特性の発現に影響を与える 1 つ以上の QTL と有意に関連するマーカーのサブセットを識別します。

1. 両親マッピング集団を選択または開発します。
2. 温室または野外条件下での特性について集団の表現型を調べます。
3. 分子マーキング システムを選択します。マッピング集団の親と多数のマーカーを持つ F1 の遺伝子型を決定し、親間で多型性を示す 200 ～ 400 個のマーカーを選択します。
4. 遺伝子型解析アプローチを選択し、多型マーカーの分子データを生成する
5. 統計プログラムを使用して、主要な QTL に関連する分子マーカーを特定します。

トウモロコシのQTLマッピングの場合:

1. KASPを使用して、1250個のSNPを持つ親とF1の遺伝子型を決定する
2. 多型SNPを特定する
3. 多型SNPで全人口の遺伝子型を決定する