分散染色

すべての液体および固体材料の光学特性は、測定に使用される光の波長に応じて変化します。波長に応じたこの変化は、光学特性の分散と呼ばれます。測定する波長ごとに対象の光学特性をプロットして作成されたグラフは、分散曲線と呼ばれます。

分散染色は光学顕微鏡で使用される分析技術であり、未知の物質の屈折率の分散曲線と既知の分散曲線を持つ標準物質の屈折率の分散曲線の差を利用して、その未知の物質を識別または特徴付ける。これらの差は、2 つの分散曲線が可視波長で交差するときに色として現れる。これは光学染色技術であり、色を出すために染料や染料を必要としない。今日、その主な用途は建築材料中のアスベストの存在を確認することである^{[1] [2] [3]}が、他にも多くの用途がある。^{[4] [5] [6] [7] [8] [9]}

分散染色法に使用される顕微鏡の基本的な光学構成は 5 つあります。各構成にはそれぞれ長所と短所があります。最初の 2 つである Becke 線分散染色法と斜め分散染色法は、1870 年代にドイツで O. Maschke が行った研究に基づいて、1911 年に米国で FE Wright が初めて報告しました。^[10] 分散染色法の 5 つの構成は次のとおりです。

1. 着色ベッケ線分散染色^[11] (Maschke, 1872; Wright, 1911)
2. 斜照明分散染色（ライト、1911）
3. 暗視野分散染色法^[12] (クロスモン、1948)
4. 位相差分散染色法^[13] (クロスモン、1949)
5. 客観的な停止分散染色^[14]（チェルカソフ、1958）

これらの構成はすべて、検査するサンプルの準備に関して同じ要件があります。まず、対象物質は既知の参照物質と密接に接触している必要があります。言い換えると、クリーンな固体を参照液体にマウントするか、1 つの鉱物相を参照鉱物相と密接に接触させるか、均質な液体に参照固体が含まれている必要があります。ほとんどのアプリケーションでは、参照液体 (マウント媒体と呼ばれる) にマウントされた固体が関係します。次に、分散色は、2 つの物質が可視スペクトルの特定の波長 (λo と呼ばれる) に対して同じ屈折率を持ち、屈折率の分散曲線が非常に異なる場合にのみ存在します。最後に、サンプルはカバーガラスの下に適切にマウントして、見られる色の解釈を複雑にする可能性のあるその他の光学効果を最小限に抑える必要があります。これらの基準が満たされると、サンプルを検査する準備が整います。

これらすべての方法で顕微鏡の初期構成は、ケーラー照明が適切に調整された状態です。各方法では、いくつかの追加調整が必要です。

ベッケ線法は、粒子は基本的にレンズのように振舞うという事実を利用しています。粒子は、中心よりも端のほうが薄い傾向があるためです。粒子の屈折率が周囲の液体よりも高い場合、粒子は凸レンズのように振舞い、光源の反対側に平行光線を集束させます。顕微鏡で見ると、顕微鏡のステージと対物レンズの間の距離が長くなるにつれて粒子の焦点が外れるにつれて、明るい光のリング、ベッケ線が端から内側に動いているように見えます。ステージを対物レンズに近づけると、粒子は虫眼鏡のように振舞い、ベッケ線の画像が拡大されて粒子の外側に現れます。

この方法の要件は、入射光線が可能な限り平行であることです。そのためには、サブステージ コンデンサーの絞りを閉じる必要があります。サブステージ コンデンサーの絞りを閉じると、粒子の解像度が低下し、他の物体が観察される効果に干渉する可能性のある被写界深度が増加します。大きな粒子の場合、これは大きな制限ではありませんが、小さな粒子の場合は問題になります。

分散染色の条件が満たされると (粒子が、可視波長範囲で屈折率が一致するが屈折率が大きく異なる液体に取り付けられる)、粒子はスペクトルの赤色部分で高い屈折率を持ち、青色部分で低い屈折率を持ちます。これは、液体は無色の固体よりも分散曲線が急峻になる傾向があるためです。その結果、粒子が焦点から外れるときに、赤色の波長は内側に焦点が合わせられます。青色の波長では、粒子は凹レンズのように動作し、青色のベッケ線は液体内に移動します。

これら 2 つの光帯の色は、粒子と液体の屈折率が一致する場所、つまり λo の位置によって異なります。一致する場所がスペクトルの青い端に近い場合、粒子に入射するベッケ線には青以外の可視波長のほとんどすべてが含まれるため、淡い黄色に見えます。出ていくベッケ線は非常に濃い青に見えます。一致する場所がスペクトルの赤い端に近い場合、粒子に入射するベッケ線は濃い赤に見え、出ていくベッケ線は淡い青に見えます。λo が可視波長の中央に近い場合、粒子に入射するベッケ線はオレンジ色になり、出ていくベッケ線は空色になります。見られる色 (図 1 を参照) は、アスベストの識別の場合のように、未知の物質の屈折率を非常に正確に判定したり、未知の物質の正体を確認したりするために使用できます。このタイプの分散染色の例と、異なる λo で表示される色は、http://microlabgallery.com/gallery-dsbecke.aspx で確認できます。2 つの色が存在することで、2 つの材料の屈折率が一致する波長を区別しやすくなります。

分散染色のベッケ線法は、主に探索的技術として使用されます。粒子フィールドをスキャンし、微細な焦点を絶えず調整すると、粒子の周囲または内部の色のフラッシュが記録され、他の方法の 1 つを使用して、一致する波長を決定する感度を高めることができます。大きな粒子 (直径 25 マイクロメートル以上) の場合、色のベッケ線は十分に明瞭で、必要な精度で波長を決定できます。非常に大きな粒子 (100 マイクロメートル以上) の場合、他の種類の光学干渉に対する感度が最も低いため、これが最適な方法である可能性があります。

斜照明分散染色は、ほとんどの粒子の凸型形状と屈折によって生じます。斜照明では、サンプルを照射する光線がサンプルに対して斜めの角度で照射されます。これにより、入射光線に対して直角に配向されている粒子の構造詳細の解像度が向上しますが、光線の方向と平行な特徴の解像度はいくらか犠牲になります。この光線の配向により、粒子とマウント液の相対屈折率が明らかになります。液体の屈折率が高い波長は、光が当たっている側に最も近い粒子側から対物レンズの前面レンズに屈折します。粒子の屈折率がすべての可視波長で高い場合、粒子のこの​​側は暗くなります。光源から最も遠い側には、粒子の屈折率が高いすべての波長が映ります。これらの効果は、粒子に焦点を絞った状態で確認できます。これは、ベッケ線法に比べて大きな利点です。なぜなら、色を見るために粒子の焦点をぼかす必要がなく、一般的にベッケ線分散色よりも色がはっきりしているからです。このタイプの分散染色で見られる色は、図 1 に示すベッケ線法で見られる色とほぼ同じです。このタイプの分散染色の例と、異なる λo で表示される色は、microlabgallery.com のベッケ線分散染色のサイトで見ることができます。2 つの色が存在することで、2 つの材料の屈折率が一致する波長を区別しやすくなります。

暗視野照明分散染色は、試料に当たるすべての直接光が対物レンズの前面レンズを外れるような角度で向いている一方で、屈折した光によってのみ粒子の画像が形成される結果です。

その結果、背景は黒くなります。視野内の物体の特徴のうち、マウント媒体の屈折率と一致しないものはすべて明るい白で表示されます。粒子が、可視波長のどこかで屈折率と一致する液体にマウントされると、それらの波長は粒子によって屈折されず、対物レンズによって収集されません。物体の画像は、残っているすべての波長によって形成されます。これらの波長が組み合わさって単一の色が生成され、どの波長帯が欠けているかを示すために使用できます (図 2 を参照)。このタイプの分散染色の例と、さまざまな λo で表示される色は、microlabgallery.com の Darkfield Dispersion Staining サイトで確認できます。この方法は、2 つのブラケット色ではなく単一の色であるため解釈がより困難ですが、可視範囲の中央付近では比較的正確です。

位相差分散染色では、サブステージコンデンサーに適切な位相環を備えた位相差対物レンズを使用して効果を確認する必要があります。これは、物体の存在によって位相がシフトしない光線が、対物レンズの後焦点面で位相シフトした光線から分離されるという事実を利用します。

これらの影響を受けない光線の強度は、その後大幅に減少します。「ポジティブ位相コントラスト」では、粒子は、マウント媒体の屈折率が高い波長に寄与する色で表示されます。位相板の物理的サイズと、それが修正される対物レンズの後焦点面へのその像のため、粒子の周囲にハローが形成されます。このハローは、粒子の屈折率が高い組み合わせの波長の色を帯びます。このタイプの分散染色で見られる色は、図 1 に示す Becke` 線法で見られる色とほぼ同じです。このタイプの分散染色の例と、異なる λo で表示される色は、位相コントラスト分散染色の microlabgallery.com サイトで見ることができます。2 つの色が存在することで、2 つの材料の屈折率が一致する波長を区別するのに役立ちます。

対物絞り分散染色は、視野内の粒子の存在によって変化しないすべての光が対物レンズの後焦点面に焦点を合わせるという事実を利用しています。サブステージコンデンサーアイリスが閉じられている場合、すべての直接光は、対物レンズの後焦点面にあるサブステージコンデンサーアイリスの開口部の小さな画像に焦点を合わせます。その位置に不透明な絞りが置かれている場合、すべての直接光がブロックされ、粒子の画像は、粒子とマウント液が一致しない波長で構成されます。これらの色は、基本的に暗視野分散染色を使用したときに見られる色と同じです。この方法の二重絞りは色の効果を高めますが、粒子の解像度も犠牲にします。粒子が積み重ねられているか非常に接近している視野では、どの小さな粒子が実際に色を生み出しているかを確かめるのが難しい場合があります。このタイプの分散染色の例と、異なる λo で表示される色については、microlabgallery.com の Objective Stop Dispersion Staining サイトで確認できます。この方法は、2 つのブラケット色ではなく単一の色であるため解釈が難しくなりますが、可視範囲の中央付近では比較的正確です。

アイザック・ニュートンは、「白色」光は実際には多くの異なる「単純な」色で構成されており、どの単純な色を使用して測定するかによって物質の光学特性が異なることを実証しました。彼は、1つまたは複数のプリズムを使用した一連の実験でこれらの事実を実証しました。^[15] 光の「単純な」または単色の色の関数としての物質の光学特性の違いは、分散と呼ばれます。彼はまた、異なる物質が異なる分散特性を持つことに初めて気付きました。「硫黄を含む」液体（有機液体）は、その比重に基づいて予想されるよりも高い屈折率を持ち、ほとんどの固体よりも急勾配の分散曲線を示しました。これらの十分に文書化された観察は、わずか2世紀余りで分析技術になりました。

顕微鏡を通して見た分散効果を記録した最初の論文は、1872年にドイツのO. Maschkeによって書かれました。^[16] この論文では、粒子が屈折率の一致する液体内にあるときに色のベッケ線が発生することについて説明されていました。この論文以前は、これらの色は顕微鏡のレンズ（色収差）の結果であり、スライドにマウントされた被写体とそれがマウントされている媒体の結果ではないと考えられていました。1884年と1895年に、Christian Christiansenは分散色の最初の分析アプリケーションであるChristiansenフィルターに関するデータを発表しました。彼は、無色透明の粉末を無色の有機液体の入ったバイアルに入れると、液体と粉末がその波長に対してのみ同じ屈折率を持つ場合、白色光から単色光を作成できることを発見しました。その波長だけが光学的に均質な媒体を認識し、バイアルを直接通過します。他の波長は、液体内の粒子によってすべての方向に散乱されます。単色光は、直接光線の経路に沿ってバイアルを通して見ることができました。他の角度では、その波長の補色が観察される。遠赤色の 700 ナノメートルの波長で粉末の屈折率と一致する液体を選択した場合、バイアルを加熱して他の波長を作成し、粉末と液体の屈折率が一致する波長を変更することができる。この手法は、どの粉末や液体にも機能しなかった。最適な効果を得るには、粉末と液体を注意深く選択して、それらの分散曲線の交点が可視波長の全範囲にわたって可能な限り大きな角度を作成する必要があった。クリスチャンセンの関心は単色フィルターの作成にあり、分析手法の開発にはなかった。分散効果の分析の可能性は、1911 年になって初めて FE ライトによって報告された。^[17] 彼は、マシュケによって記録された色のベッケ線を使用して、屈折率は同じだが分散曲線が異なる 2 つの材料を区別できることを観察した。色は、粒子とそれが取り付けられている液体の屈折率が一致する可視光スペクトルの領域を示すこともできる。ライト氏はまた、斜め透過照明を使用することで、ベッケ線を検査しなくても粒子がこれらの色を示すことにも注目した。

技術文献では、1948 年まで分散効果についての追加的な議論はほとんどありませんでした。その年、SC Crossmon、NB Dodge、および共著者の RC Emmons と RN Gates は全員、顕微鏡を通して分散効果を使用して粒子を特徴付けることについて論文を書きました。^{[18] [19] [20]} Crossmon は、「クリスチャンセン効果」を使用して無色の粒子の画像に色を生成する光学技術として「分散染色」という用語を作り出したようです。^[21] 彼は、ベッケ線、斜照明、暗視野、および位相差分散染色法の使用を実証しました。SC Crossmon と WC McCrone は、それ以来、対物レンズ後焦点面ストップ分散染色技術の使用に関する多数の論文を発表しています。 A.チェルカソフは1958年にこのテーマに関する優れた論文を発表し、1960年に英語に翻訳されました。 ^[22] 1950年頃から分散染色のさまざまな方法とその応用に関する100を超える論文が書かれており、そのほとんどは1960年以降に書かれています。

この技術に関する研究は初期から行われていましたが、顕微鏡学者の間で広く知られるようになったのは 1950 年代になってからでした。現在では、材料の特性評価や低レベルの汚染物質の検出に強力なツールとして認識されています。この技術は、100 万分の 1 単位までの粉末中の粒子汚染物質に対する感度を実証しています。

屈折率の分散は物質の基本的な特性です。これは、化合物内の外殻電子の高調波周波数が可視光の周波数に比較的近いことによる結果であると考えられます。結合電子の高調波周波数は、その結合のエネルギーの結果です。結合が非常に強い場合、周波数は非常に高くなります。周波数が高くなるほど、青から赤までの周波数の差が屈折率に与える影響は少なくなります。ほとんどの無機固体の比較的高エネルギー結合の場合、これは屈折率が可視周波数範囲でほとんど変化しないことを意味します。一方、結合エネルギーが低い有機化合物の屈折率は、可視範囲で大幅に変化します。この分散の違いが、クリスチャンセン効果と分散染色法の基礎となっています。

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